🍄 Mikotoksyny — aflatoksyny, ochratoksyna A
Oznaczanie mikotoksyn (aflatoksyn B1, B2, G1, G2 i ochratoksyny A) w żywności metodą oczyszczania na kolumnach immunopowinowactwa (IAC) z detekcją HPLC-FLD.
Przegląd
Mikotoksyny to toksyczne metabolity wtórne pleśni (Aspergillus, Penicillium, Fusarium) stanowiące poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Aflatoksyna B1 jest najsilniejszym znanym naturalnym kancerogenem (Grupa 1 IARC), a ochratoksyna A jest nefrotoksyczna i prawdopodobnie rakotwórcza (Grupa 2B). Przepisy UE (Rozp. WE 1881/2006, Rozp. UE 2023/915) ustanawiają rygorystyczne limity w żywności: aflatoksyna B1 2–12 µg/kg, suma aflatoksyn 4–15 µg/kg, ochratoksyna A 3–10 µg/kg.
Metoda analityczna oparta na normach EN 14123 (aflatoksyny) i EN 15851 (ochratoksyna A) polega na ekstrakcji próbki mieszaniną acetonitryl/woda (lub metanol/woda), oczyszczaniu na kolumnach immunopowinowactwa (IAC) i oznaczeniu HPLC z detekcją fluorescencyjną (FLD). Kolumny IAC zawierają przeciwciała monoklonalne specyficznie wiążące mikotoksyny docelowe, co zapewnia wysoką selektywność oczyszczania.
Aflatoksyny B1 i G1 wymagają derywatyzacji pofluorescencyjnej (bromowanie jodem lub kobaltem, fotochemiczna UV lub elektrochemiczna KOBRA Cell) w celu wzmocnienia sygnału fluorescencji. Aflatoksyny B2 i G2 fluoryzują natywnie. Ochratoksyna A ma silną natywną fluorescencję i nie wymaga derywatyzacji.
Alternatywnie stosuje się detekcję LC-MS/MS (bez derywatyzacji), co pozwala na jednoczesne oznaczanie wielu mikotoksyn (aflatoksyny, ochratoksyna, deoksyniwalenol, zearalenon, fumonizyny, T-2/HT-2) w jednym badaniu (metoda multi-mikotoksynowa). Kolumny VICAM Myco6in1+ lub R-Biopharm EASI-EXTRACT umożliwiają oczyszczanie wielu mikotoksyn jednocześnie.
Zasada metody
Ekstrakcja: Próbka (25–50 g) jest ekstrahowana mieszaniną acetonitryl/woda (80:20 v/v) lub metanol/woda (80:20) z NaCl. Oczyszczanie IAC: Rozcieńczony ekstrakt jest przepuszczany przez kolumnę immunopowinowactwa (np. VICAM AflaOchra, R-Biopharm EASI-EXTRACT). Mikotoksyny wiążą się selektywnie z przeciwciałami na kolumnie, a zanieczyszczenia matrycowe są odmywane wodą. Mikotoksyny są eluowane metanolem (1–3 mL). Detekcja HPLC-FLD: Eluat jest nastrzykiwany na kolumnę C18. Aflatoksyny są derywatyzowane (KOBRA Cell — bromowanie elektrochemiczne). Detekcja fluorescencyjna: λex 365 nm / λem 435 nm (aflatoksyny), λex 333 nm / λem 460 nm (ochratoksyna A). Kwantyfikacja z krzywych kalibracyjnych.
Zastosowania
- Urzędowa kontrola aflatoksyn w orzechach, zbożach, przyprawach (Rozp. UE 2023/915)
- Oznaczanie ochratoksyny A w zbożach, kawie, winie, kakao
- Kontrola pasz i surowców paszowych (aflatoksyna B1)
- Badanie żywności dla niemowląt (najniższe limity: 0,10 µg/kg)
- Monitoring mleka — aflatoksyna M1 (limit 0,050 µg/kg)
- Kontrola suszonych owoców (figi, rodzynki, morele)
- Certyfikacja BRC/IFS importowanych surowców
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Anality | Aflatoksyny B1, B2, G1, G2; Ochratoksyna A |
| LOQ aflatoksyna B1 | 0,05–0,50 µg/kg |
| LOQ ochratoksyna A | 0,10–1,0 µg/kg |
| Odzysk | 70–110% (zależnie od matrycy i analitu) |
| Detekcja | HPLC-FLD (fluorescencja) lub LC-MS/MS |
| Limity UE (afla B1) | 2–12 µg/kg (zależnie od produktu) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN 14123:2008 / PN-EN 15851:2010
- Tytuł (PL)
- Żywność — Oznaczanie aflatoksyn B1, B2, G1, G2 i ochratoksyny A z zastosowaniem kolumnek immunopowinowactwa i HPLC
- Title (EN)
- Foodstuffs — Determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2 and ochratoxin A using immunoaffinity column clean-up and HPLC
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie próbki
Zmiel/zhomogenizuj próbkę (min. 100 g). Odważ 25 g do kolby stożkowej.
2. Ekstrakcja
Dodaj 5 g NaCl i 100 mL acetonitrylu/wody (80:20). Wytrząsaj intensywnie 30 min (wytrząsarka orbitalna).
3. Filtracja i rozcieńczenie
Przesącz przez sączek fałdowany. Pobierz alikwot (np. 10 mL) i rozcieńcz PBS do 50 mL (obniżenie stężenia MeCN < 25%).
4. Oczyszczanie IAC
Przepuść rozcieńczony ekstrakt przez kolumnę IAC (przepływ 1–2 krople/s). Mikotoksyny wiążą się z przeciwciałami.
5. Przemywanie
Przemyj kolumnę 20 mL wody dejonizowanej (usunięcie zanieczyszczeń matrycowych). Odsysaj powietrze 30 s.
6. Elucja
Eluuj mikotoksyny 1,5 mL metanolu (przepływ 1 kropla/2 s). Zbierz do fiolki HPLC. Odparuj do sucha pod N₂ i odtwórz w fazie ruchomej.
7. Nastrzyknięcie HPLC
Nastrzyknij 50–100 µL na kolumnę C18. Faza ruchoma: H₂O/MeCN/MeOH z kwasem octowym. Gradient lub izokratycznie.
8. Detekcja FLD
Detekcja fluorescencyjna z celą KOBRA: aflatoksyny λex 365 / λem 435 nm, ochratoksyna A λex 333 / λem 460 nm.
9. Kwantyfikacja
Oblicz stężenia z krzywych kalibracyjnych (5–7 punktów). Uwzględnij współczynnik rozcieńczenia i masę próbki.
10. Kontrola jakości
Co serię: ślepa, próbka fortyfikowana, CRM (FAPAS/BIPEA). Odzysk aflatoksyn 70–110%, ochratoksyny 70–110%. Uczestnictwo w PT.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| System HPLC z detektorem FLD | Shimadzu Nexera + RF-20Axs, Agilent 1260 Infinity II + FLD, Waters Alliance + FLR | 150 000–350 000 PLN |
| System LC-MS/MS (alternatywa) | Shimadzu LCMS-8060NX, Waters Xevo TQ-XS | 600 000–1 200 000 PLN |
| Cela derywatyzacyjna KOBRA | R-Biopharm KOBRA Cell (bromowanie elektrochemiczne) | 15 000–25 000 PLN |
| Kolumny immunopowinowactwa (IAC) | VICAM AflaTest / OchraTest / AflaOchra, opak. 25 szt. | 2 500–5 000 PLN / 25 szt. |
| Kolumna HPLC C18 | Waters Symmetry C18 (150 × 4,6 mm, 5 µm), Phenomenex Kinetex | 1 500–3 000 PLN |
| System próżniowy do IAC | Manifold próżniowy 12/24-pozycyjny, SUPELCO Visiprep | 3 000–8 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Acetonitryl HPLC grade | 75-05-8 | Faza ruchoma HPLC i ekstrakcja, 2,5 L |
| Metanol HPLC grade | 67-56-1 | Elucja z IAC i faza ruchoma, 2,5 L |
| Wzorce aflatoksyn B1, B2, G1, G2 | — | Certyfikowane CRM (Romer Labs, Trilogy), roztwory w MeCN, 5 mL |
| Wzorzec ochratoksyny A | 303-47-9 | Certyfikowany CRM, roztwór w MeCN lub toluenie, 1 mL |
| Bromek potasu KBr (KOBRA Cell) | 7758-02-3 | Sól do celi elektrochemicznej, generowanie Br⁻ in-situ |
| Kwas azotowy HNO₃ 4 mol/L (KOBRA Cell) | 7697-37-2 | Elektrolit do celi KOBRA |
| PBS (bufor fosforanowy pH 7,4) | — | Do rozcieńczania ekstraktu przed IAC, tabletki lub gotowy |
| Chlorek sodu NaCl | 7647-14-5 | Dodatek do ekstrakcji (poprawa rozdziału faz) |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Aflatoksyny — silnie rakotwórcze (Grupa 1 IARC). Stosować rękawice podwójne, pracować w wydzielonym obszarze.
- Wzorce mikotoksyn — toksyczne. Przechowywać w zamrażarce (-20°C). Roztwory sporządzać pod dygestorium.
- Acetonitryl — łatwopalny i toksyczny (H225, H302, H312, H332). Pracować pod wyciągiem.
- Metanol — łatwopalny i toksyczny (H225, H301, H311, H331). Toksyczny przy wdychaniu i połknięciu.
- Dekontaminacja aflatoksyn — roztwór podchlorynu sodu (NaOCl 5%) neutralizuje aflatoksyny na powierzchniach.
- Odpady zawierające mikotoksyny — zbierać oddzielnie i neutralizować chemicznie przed utylizacją.