🦠 Mezofilne bakterie fermentacji mlekowej w żywności — metoda płytkowa na agarze MRS (pH 5,7), 30 °C, 72 h

Mikrobiologia PN-ISO 15214

Przegląd

ISO 15214:1998 określa horyzontalną metodę oznaczania liczby żywych mezofilnych bakterii fermentacji mlekowej przez liczenie kolonii rosnących w podłożu stałym po inkubacji w 30 °C przez 3 dni; stosuje się ją do produktów dla ludzi i pasz. W niektórych produktach występują psychrotrofowe lub termofilne bakterie mlekowe wymagające innych temperatur, a nie wszystkie bakterie mlekowe rosną na agarze MRS o pH 5,7 (niektóre słabo). Mezofilne bakterie fermentacji mlekowej definiuje się jako bakterie tworzące kolonie w 30 °C w stałym podłożu selektywnym (MRS o pH 5,7) w warunkach badania. Zbuforowana woda peptonowa nie zawsze zapewnia dobrą rewitalizację bakterii mlekowych (załącznik A). W polskiej literaturze naukowej (np. badania przeżywalności szczepów Lactobacillus w modelowym przewodzie pokarmowym, ŻNTJ 2015) liczbę komórek bakterii oznacza się „zgodnie z PN-ISO 15214:2002 na podłożu stałym MRS”; w dydaktyce (UWM) jogurty i fermentowane soki warzywne posiewa się po 0,1 ml rozcieńczeń na płytki MRS z inkubacją w pojemnikach do beztlenowców z saszetkami.

Zasada metody

Przygotowuje się dwie płytki z agarem MRS o pH 5,7 posiane wgłębnie (lub ewentualnie powierzchniowo) określoną ilością próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej oraz kolejne pary płytek z rozcieńczeń dziesiętnych; płytki inkubuje się w 30 °C przez 72 h; liczbę bakterii na g lub ml oblicza się z liczby kolonii na wybranych płytkach, ewentualnie po potwierdzeniu. Podłoże MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) na 1000 ml: hydrolizat kazeiny 10 g, ekstrakt mięsny 10 g, ekstrakt drożdżowy 4 g, cytrynian triamonowy 2 g, octan sodu 5 g, MgSO₄·7H₂O 0,2 g, MnSO₄·4H₂O 0,05 g, K₂HPO₄ 2 g, glukoza 20 g, Tween 80 1,08 g, agar 12–18 g; składniki rozpuszcza się przez gotowanie, pH nastawia tak, by po sterylizacji wynosiło 5,7 ± 0,1 w 25 °C (tolerancja ± 0,1, aby pH nie spadło poniżej 5,6), sterylizuje 15 min w 121 °C i chłodzi do ok. 47 °C (przechowywane podłoże topi się we wrzącej łaźni i chłodzi do 47 °C). Przy ryzyku obfitego zanieczyszczenia drożdżami (np. kiełbasy suszone) dodaje się kwas sorbowy: 1,4 g rozpuszczone w ok. 10 ml 1 mol/l NaOH, sterylizowane filtracyjnie, do 1000 ml MRS ostudzonego do 47 °C, pH końcowe 5,7 ± 0,1. Gotowe podłoża handlowe są dopuszczalne, ale ich skład i pH mogą się różnić i dawać inne wyniki. Posiew powierzchniowy z inkubacją beztlenową lub mikroaerofilną (słoje ze świecą) oraz podłoże dwuwarstwowe są dopuszczalne. Niektóre Leuconostoc tworzą duże śluzowate kolonie utrudniające rozwój innych (zaniżenie); z powodu możliwego wzrostu innych drobnoustrojów na MRS w niektórych produktach kolonie potwierdza się prostymi testami (barwienie Grama, katalaza) — odnotowując to w sprawozdaniu. Obliczenie: N = ΣC / [V·(n₁ + 0,1·n₂)·d], zaokrąglone do dwóch cyfr znaczących; przy < 15 koloniach na płytkach z próbki/zawiesiny wyjściowej podaje się liczbę szacunkową (średnia arytmetyczna y; NE = y dla produktów płynnych, y/d dla pozostałych).

Zastosowania

• Produkty fermentowane: jogurty, kefiry, sery, kiszonki, fermentowane soki warzywne, kiełbasy dojrzewające — kontrola kultur starterowych i liczby żywych bakterii
• Probiotyki i suplementy (liczba żywych komórek Lactobacillus), badania przeżywalności w modelowym przewodzie pokarmowym
• Ocena psucia produktów przez bakterie mlekowe (mięso pakowane próżniowo, sałatki, napoje)
• Pasze i kiszonki (inokulanty), surowce roślinne
• Kontrola jakości podłoża MRS i kultur w mleczarstwie

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-ISO 15214:2002 (ISO 15214:1998)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby mezofilnych bakterii fermentacji mlekowej — Metoda płytkowa w temperaturze 30 stopni C

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactic acid bacteria — Colony-count technique at 30 °C

Procedura krok po kroku

1. Podłoże

   Rozpuść składniki MRS przez gotowanie, nastaw pH tak, by po sterylizacji wynosiło 5,7 ± 0,1 w 25 °C, sterylizuj 15 min w 121 °C i ostudź do ok. 47 °C (przechowywane podłoże stop we wrzącej łaźni i ostudź do 47 °C); przy ryzyku drożdży dodaj przefiltrowany roztwór kwasu sorbowego (1,4 g w ok. 10 ml 1 mol/l NaOH na 1 l).

2. Próbka i rozcieńczenia

   Przygotuj zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesiętne wg ISO 6887-1; próbka ma być reprezentatywna i nieuszkodzona w transporcie.

3. Posiew

   Do dwóch jałowych płytek przenieś po 1 ml próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej, do kolejnych par — po 1 ml kolejnych rozcieńczeń (nowa pipeta na każde rozcieńczenie); przy dużych liczbach posiej tylko rozcieńczenia potrzebne do liczenia.

4. Zalanie

   Wlej do każdej płytki ok. 15 ml MRS o temperaturze ok. 47 °C, ostrożnie wymieszaj i pozostaw do zestalenia (alternatywnie posiew powierzchniowy z inkubacją beztlenową lub mikroaerofilną albo MRS dwuwarstwowy).

5. Inkubacja

   Odwrócone płytki inkubuj w 30 °C przez 72 h ± 3 h, chroniąc agar przed wysychaniem.

6. Liczenie i potwierdzenie

   Policz kolonie na płytkach z < 300 kolonii w dwóch kolejnych rozcieńczeniach i ≥ 15 na co najmniej jednej; uwzględnij możliwe śluzowate kolonie Leuconostoc; w razie potrzeby potwierdź kolonie barwieniem Grama i testem katalazy (odnotuj w sprawozdaniu).

7. Obliczenie

   N = ΣC/[V(n₁ + 0,1n₂)d] (np. (168 + 215 + 14 + 25)/[1·(2 + 0,2)·10⁻²] = 19 182 → 1,9 × 10⁴/g); przy < 15 kolonii — liczba szacunkowa NE = y (płynne) lub y/d (inne); wynik jako 1,0–9,9 × 10ⁿ na g lub ml.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Bakterie mlekowe nie są patogenne, ale próbki żywności mogą zawierać patogeny — dobra praktyka mikrobiologiczna
• Gorący agar (47 °C) i wrząca łaźnia — ochrona przed poparzeniem; 1 mol/l NaOH — żrący
• Słoje beztlenowe ze świecą lub generatorami — ostrożnie z otwartym ogniem i wodorem

Najczęstsze pytania