🦠 Listeria monocytogenes i Listeria spp. w żywności — oznaczanie liczby na agarze ALOA (Ottaviani-Agosti)

Mikrobiologia PN-EN ISO 11290-2

Przegląd

ISO 11290-2:2017 określa horyzontalną metodę oznaczania liczby L. monocytogenes oraz Listeria spp. (włącznie z L. monocytogenes) w produktach dla ludzi i zwierząt oraz w próbkach środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością; niektóre nowo opisane gatunki Listeria mogą nie być tą metodą oznaczane lub potwierdzane. Drugie wydanie zastąpiło ISO 11290-2:1998 z poprawką A1:2004; główne zmiany: zawiesina wyjściowa w zbuforowanej wodzie peptonowej lub bulionie pół-Frasera (z suplementami lub bez) i rozcieńczalnikach z ISO 6887, usunięcie etapu rewitalizacji, testy mikroskopowy, katalazy i CAMP jako opcjonalne, nowe charakterystyki wykonania oraz włączenie oznaczania Listeria spp. do zakresu. Zmiany uznano za istotne (ISO 17468), ale bez znaczącego wpływu na charakterystyki metody. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 wskazuje EN/ISO 11290-2 jako metodę referencyjną kryterium bezpieczeństwa 100 jtk/g dla żywności gotowej do spożycia (w której możliwy lub niemożliwy jest wzrost L. monocytogenes; plan 5 próbek, c = 0). Listeria to Gram-dodatnie, krótkie pałeczki bez przetrwalników i otoczki, względnie beztlenowe i psychrotrofowe, ruchliwe w 20–25 °C, katalazo-dodatnie i oksydazo-ujemne; L. monocytogenes rośnie od −2 °C do 45 °C i przy pH 4,4–9, a listerioza ma śmiertelność 20–30 % — badania trzeba prowadzić w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, a osoby w ciąży i z obniżoną odpornością komórkową nie powinny pracować z hodowlami.

Zasada metody

Oznaczanie wymaga pięciu kolejnych etapów (schemat w załączniku A): przygotowanie zawiesiny wyjściowej w rozcieńczalniku odpowiednim do próbki; posiew powierzchniowy na agar Listeria wg Ottaviani i Agosti określonej ilości próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej i w razie potrzeby rozcieńczeń dziesiętnych; inkubacja w 37 °C z oceną po 24 h i po dalszych 24 h; potwierdzenie kolonii domniemanych testami morfologicznymi i biochemicznymi; obliczenie liczby na g, ml, cm² lub urządzenie do pobierania. Jako rozcieńczalnik zawiesiny wyjściowej służy zbuforowana woda peptonowa lub inne z ISO 6887; gdy na tej samej próbce wykonuje się też wykrywanie wg ISO 11290-1, można użyć bulionu pół-Frasera (z czynnikami selektywnymi dodanymi najlepiej po posiewie do oznaczania; przy suplementowanym pół-Fraserze płytki posiać do 45 min). Posiewa się 0,1 ml na małą płytkę (90 mm); dla niskich liczb granicę wykrywalności obniża się dziesięciokrotnie, badając 1 ml rozprowadzony na dużej płytce (140 mm) lub trzech małych (z duplikatem, gdy używa się tylko zawiesiny wyjściowej); inokulum rozprowadza się szybko głaszczką bez dotykania brzegów i pozostawia ok. 15 min do wchłonięcia. Płytki inkubuje się odwrócone w 37 °C 24 h ± 2 h i dalsze 24 h ± 2 h. L. monocytogenes tworzy niebieskozielone kolonie otoczone mętną (opalizującą) strefą (tak samo L. ivanovii; szczepy po stresie kwasowym mogą mieć słabą lub żadną otoczkę; rzadkie szczepy o wolnej aktywności PIPLC ujawniają się po > 4 dniach); Listeria spp. — niebieskozielone z otoczką lub bez (inne organizmy mogą dawać niebieskie kolonie — załącznik C). Liczy się płytki z < 150 kolonii charakterystycznych (< 360 na 140 mm), a przy mieszanych hodowlach lub dużych nakładających się otoczkach — < 100 (< 240). Do potwierdzenia pobiera się z każdej płytki 5 kolonii reprezentatywnych dla typów, przesiewa na podłoże nieselektywne (agar z krwią, agar odżywczy, TSYEA) i inkubuje 37 °C 18–24 h. Testy obowiązkowe dla L. monocytogenes: β-hemoliza +, L-ramnoza +, D-ksyloza −; opcjonalne: obraz mikroskopowy (cienkie krótkie pałeczki/ziarniakopałeczki), katalaza +, ruch w 25 °C +, test CAMP +; rzadkie szczepy niehemolityczne wymagają dodatkowych testów (Gram, katalaza, ruch, CAMP, PCR). Dopuszczalne są miniaturowe galerie biochemiczne i procedury alternatywne wg ISO 7218 po weryfikacji przydatności.

Zastosowania

• Kryterium bezpieczeństwa 100 jtk/g L. monocytogenes w żywności gotowej do spożycia — metoda referencyjna rozp. (WE) 2073/2005 (kat. 1.2 i 1.3)
• Sery i przetwory mleczne, wędliny i wyroby mięsne gotowe do spożycia, ryby wędzone, sałatki, produkty chłodzone o długim terminie przydatności
• Próbki środowiskowe (powierzchnie, sprzęt) w zakładach produkujących żywność RTE — monitoring Listeria spp. jako wskaźnika
• Pasze i surowce; badania trwałości (challenge tests) wymagające liczby Listeria
• Łączone badanie wykrywania (ISO 11290-1) i oznaczania liczby z jednej zawiesiny w bulionie pół-Frasera

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 11290-2:2017-07 (ISO 11290-2:2017)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i innych Listeria spp. — Część 2: Metoda oznaczania liczby

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 2: Enumeration method

Procedura krok po kroku

1. Próbka i zawiesina

   Przygotuj próbkę wg ISO 6887 (lub ISO 18593 dla powierzchni); zawiesinę wyjściową sporządź w zbuforowanej wodzie peptonowej lub innym rozcieńczalniku z ISO 6887 albo w bulionie pół-Frasera, gdy równocześnie wykonujesz wykrywanie wg ISO 11290-1 (suplement dodaj po posiewie; z suplementem posiej do 45 min).

2. Posiew powierzchniowy

   Nanieś 0,1 ml zawiesiny (lub próbki płynnej) i 0,1 ml kolejnych rozcieńczeń na płytki 90 mm ALOA; dla niskich liczb — 1 ml na płytkę 140 mm lub na trzy płytki 90 mm (wysuszone), z duplikatem gdy używasz tylko zawiesiny wyjściowej. Rozprowadź szybko głaszczką (nowa na każde rozcieńczenie lub ta sama od najwyższego rozcieńczenia) i pozostaw ok. 15 min do wchłonięcia.

3. Inkubacja

   Inkubuj odwrócone płytki w 37 °C 24 h ± 2 h, oceń i inkubuj dalsze 24 h ± 2 h.

4. Liczenie

   Po 24 h (zanim otoczki się nałożą) i po 48 h policz niebieskozielone kolonie z mętną otoczką (domniemane L. monocytogenes) oraz niebieskozielone z otoczką lub bez (domniemane Listeria spp.) na płytkach z < 150 (90 mm) lub < 360 (140 mm) kolonii charakterystycznych; przy hodowlach mieszanych lub dużych otoczkach — < 100 / < 240. Trzy płytki 90 mm z 1 ml traktuj jako jedną.

5. Potwierdzenie

   Z każdej płytki (rozcieńczenia) pobierz 5 kolonii reprezentatywnych dla typów (przy < 5 — wszystkie), przesiej na podłoże nieselektywne (L. monocytogenes: agar z krwią, odżywczy lub TSYEA; Listeria spp.: TSYEA) i inkubuj 37 °C 18–24 h. Wykonaj testy obowiązkowe: β-hemoliza, L-ramnoza, D-ksyloza (z kontrolami), opcjonalnie katalazę, ruch w 25 °C, CAMP i obraz mikroskopowy; przy koloniach typowych bez hemolizy — testy dodatkowe (Gram, katalaza, ruch, CAMP, PCR).

6. Obliczenie i sprawozdanie

   Z liczby kolonii potwierdzonych oblicz liczbę L. monocytogenes i/lub Listeria spp. na g, ml, cm² lub urządzenie do pobierania próbek; porównaj z kryterium 100 jtk/g (rozp. 2073/2005) i opisz odstępstwa.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• L. monocytogenes — praca wyłącznie w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, pod nadzorem mikrobiologa, ze staranną utylizacją inkubowanych materiałów
• Osoby w ciąży oraz z chorobami upośledzającymi odporność komórkową nie powinny pracować z hodowlami Listeria (ryzyko dla płodu)
• Testy CAMP z S. aureus i R. equi oraz agar z krwią — postępowanie jak z materiałem zakaźnym

Najczęstsze pytania