🔴 Wykrywanie Listeria monocytogenes
Dwustopniowa metoda namnożenia selektywnego i posiewu na podłoża chromogenne do wykrywania Listeria monocytogenes w żywności. Kluczowe badanie bezpieczeństwa żywności.
Przegląd
Listeria monocytogenes to Gram-dodatnia pałeczka będąca jednym z najgroźniejszych patogenów przenoszonych drogą pokarmową. Wywołuje listeriozę — chorobę o śmiertelności 20–30% (najwyższa wśród chorób pokarmowych). Szczególnie zagrożone są kobiety w ciąży (poronienia, zakażenie noworodków), osoby starsze i osoby z obniżoną odpornością.
L. monocytogenes jest wyjątkowo niebezpieczna, ponieważ: namnaża się w temperaturze lodówkowej (2–4°C), toleruje wysokie stężenia soli (do 10% NaCl), przeżywa w szerokim zakresie pH (4,4–9,6). Tworzy biofilmy na powierzchniach zakładów spożywczych, co utrudnia jej eliminację.
Norma PN-EN ISO 11290-1 jest metodą referencyjną wykrywania L. monocytogenes we wszystkich rodzajach żywności i pasz. Wymagana przez Rozporządzenie (WE) 2073/2005 — kryterium bezpieczeństwa: nieobecna w 25 g dla żywności gotowej do spożycia przeznaczonej dla niemowląt i celów medycznych, oraz ≤100 jtk/g w żywności gotowej do spożycia w okresie przydatności do spożycia.
Zasada metody
Metoda dwustopniowego namnożenia selektywnego:
1. **Pierwotne namnożenie (Half Fraser)** — 25 g próbki + 225 mL bulionu Half Fraser (połowa stężenia akryflawininy i kwasu nalidyksowego). Inkubacja 30°C / 24–26h. Łagodna selekcja umożliwiająca regenerację uszkodzonych komórek. 2. **Wtórne namnożenie (Fraser pełny)** — 0,1 mL → 10 mL bulionu Fraser (pełne stężenie inhibitorów). Inkubacja 37°C / 24–48h. Pociemnienie bulionu (hydroliza eskuliny → czarny osad) sugeruje obecność Listeria. 3. **Posiew na podłoża selektywne** — ALOA (chromogenne) i Oxford/PALCAM. Kolonie L. monocytogenes na ALOA: niebiesko-zielone z nieprzezroczystą strefą (fosfatydyloinozytol-specyficzna fosfolipaza C, PI-PLC). 4. **Potwierdzenie** — hemoliza na agarze z krwią, test CAMP, ruchliwość w 25°C (parasol), fermentacja cukrów (ramnoza+, ksyloza-).
Zastosowania
- Żywność gotowa do spożycia — sery miękkie, wędliny, ryby wędzone
- Produkty dla niemowląt i cele medyczne specjalnego przeznaczenia
- Mięso i przetwory mięsne (drób, wieprzowina)
- Produkty rybne — surowe i wędzone (łosoś, makrela)
- Produkty mleczne — sery, lody, mleko pasteryzowane
- Warzywa i owoce gotowe do spożycia (sałatki, smoothie)
- Monitoring środowiskowy zakładów (wymazy z powierzchni, drenów, chłodni)
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Wynik | Wykryto / Nie wykryto w 25 g |
| Wielkość próbki | 25 g (standard) |
| Czas do wyniku | 5–7 dni roboczych |
| Temperatura namnożenia I | 30 ± 1°C (Half Fraser) |
| Temperatura namnożenia II | 37 ± 1°C (Fraser) |
| Granica wykrywania | 1 komórka / 25 g |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 11290-1:2017
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i Listeria spp. — Część 1: Metoda wykrywania
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie próbki
Odważ 25 g próbki do worka stomachera. Dodaj 225 mL bulionu Half Fraser. Homogenizuj 1–2 min.
2. Namnożenie I — Half Fraser
Inkubuj worek z próbką w 30±1°C przez 24–26 godzin. Po inkubacji obserwuj bulion — pociemnienie sugeruje hydrolizę eskuliny (obecność Listeria spp.).
3. Namnożenie II — Fraser pełny
Przenieś 0,1 mL namnożenia Half Fraser do 10 mL bulionu Fraser (pełnego). Inkubuj 37±1°C / 24 godziny (odczyt) i do 48 godzin (drugi odczyt).
4. Posiew z Half Fraser (24h)
Z namnożenia Half Fraser posiej oczkiem na agar ALOA i drugie podłoże (Oxford lub PALCAM). Inkubuj 37°C / 24–48h.
5. Posiew z Fraser (24h i 48h)
Po 24h i po 48h bulionu Fraser posiej oczkiem na agar ALOA i drugie podłoże. Inkubuj 37°C / 24–48h.
6. Odczyt płytek
Na ALOA: kolonie L. monocytogenes = niebiesko-zielone z nieprzezroczystą otoczką (PI-PLC+). Na Oxford: czarne kolonie z czarną strefą (eskulina+).
7. Izolacja czystych kultur
Wybierz min. 5 kolonii podejrzanych. Przesiej na agar TSYEA. Inkubuj 37°C / 18–24h. Obserwuj kolonie: L. monocytogenes — drobne, szarawe, lśniące w oświetleniu Henry (niebiesko-szary blask).
8. Test hemolityczny
Z czystej kultury posiej na agar z krwią baranią 5%. Inkubuj 37°C/24h. L. monocytogenes: wąska strefa β-hemolizy (przejrzysta otoczka wokół kolonii).
9. Test CAMP
Na agar z krwią posiej pionowo S. aureus i R. equi. Prostopadle posiej badany szczep. Inkubuj 37°C/18–24h. L. monocytogenes: wzmocniona hemoliza przy S. aureus, brak przy R. equi.
10. Ruchliwość
Zaszczep podłoże półpłynne (agar ruchliwości 0,4%). Inkubuj 25°C/48h. L. monocytogenes: wzrost "parasola" 2–5 mm pod powierzchnią (ruchliwa w 25°C, nieruchoma w 37°C).
11. Fermentacja cukrów
Ramnoza: DODATNIA (L. monocytogenes). Ksyloza: UJEMNA. Manitol: UJEMNA. Te 3 testy odróżniają L. monocytogenes od innych gatunków Listeria.
12. Interpretacja i raportowanie
Potwierdzenie = hemoliza β + CAMP+ przy S. aureus + ruchliwość parasol + ramnoza+ ksyloza- → "Listeria monocytogenes WYKRYTO w 25 g". Brak = "NIE WYKRYTO".
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator 30±1°C | Memmert IN110, Binder BD 115 | 5 000–15 000 PLN |
| Inkubator 37±1°C | Memmert IN110, POL-EKO ST 2 | 5 000–15 000 PLN |
| Stomacher | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| Autoklaw | Tuttnauer 3870ELV, Systec VX-75 | 30 000–80 000 PLN |
| Komora laminarna klasy II | ESCO Airstream, Thermo MSC-Advantage | 25 000–60 000 PLN |
| Mikroskop z oświetleniem Henry | Olimpus CX43, do obserwacji morfologii kolonii | 8 000–20 000 PLN |
| Pipety automatyczne | Eppendorf Research Plus 0,1 mL + 1 mL | 800–1 500 PLN/szt. |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Bulion Half Fraser | — | Podstawa Fraser + połowa stężenia akryflawininy (12,5 mg/L) i kw. nalidyksowego (10 mg/L). Merck 1.10398, Oxoid CM0895. |
| Bulion Fraser (pełny) | — | Pełne stężenie inhibitorów: akryflawinina 25 mg/L, kw. nalidyksowy 20 mg/L, chlorek litu 3 g/L, eskulina + amonowy cytrynian żelazawy. Merck 1.10399. |
| Agar ALOA (chromogenny) | — | Podłoże chromogenne: L. monocytogenes = niebiesko-zielone kolonie z nieprzezroczystą strefą (PI-PLC+). Inne Listeria = niebiesko-zielone BEZ strefy. Merck 1.00427, bioMérieux. |
| Agar Oxford | — | Z suplementem (cykloheksymidem, kolistyną, akryflawiną, cefotetanem, fosforanami). Kolonie: czarne z czarną strefą (eskulina). Oxoid CM0856. |
| Agar TSYEA | — | Tryptic Soy Yeast Extract Agar — do izolacji czystych kultur. TSA + 0,6% ekstrakt drożdżowy. |
| Agar z krwią baranią 5% | — | Do testu hemolitycznego — L. monocytogenes daje wąską strefę β-hemolizy. |
| Szczep Staphylococcus aureus ATCC 25923 | — | Do testu CAMP — wzmocnienie hemolizy w strefie S. aureus. |
| Szczep Rhodococcus equi ATCC 6939 | — | Do testu CAMP — brak wzmocnienia (odróżnienie od L. ivanovii). |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Listeria monocytogenes — patogen BSL-2! Praca wyłącznie w komorze laminarnej
- Szczególnie niebezpieczna dla kobiet w ciąży — zakaz pracy z L. monocytogenes dla pracownic w ciąży
- Rękawice nitrylowe, fartuch, okulary ochronne obowiązkowe
- Wszystkie odpady autoklawitować (121°C/20 min) przed utylizacją
- Dezynfekcja stanowiska po pracy: 70% etanol + 0,5% roztwór podchlorynu sodu
- Krew barania — źródło potencjalnych alergenów, postępować ostrożnie