🦠 Oznaczanie liczby komórek somatycznych w mleku surowym i konserwowanym chemicznie metodą mikroskopową (metoda odniesienia) — 0,01 ml próbki rozprowadzone na polu 1 cm² szkiełka, suszenie, barwienie roztworem Newmana-Lamperta (≥ 15 min) albo bromkiem etydyny (mikroskop fluorescencyjny), liczenie komórek z jądrem w określonej powierzchni i przeliczenie współczynnikiem roboczym na komórki w mililitrze, PN-EN ISO 13366-1

Mikrobiologia PN-EN ISO 13366-1

Przegląd

CO TA NORMA OPISUJE. Zakres z karty PKN PN-EN ISO 13366-1:2009 (wersja polska), w całości: „Opisano metodę liczenia komórek somatycznych w mleku surowym i mleku konserwowanym chemicznie. Metodę przeznaczono do przygotowania standardowych próbek do badania oraz oznaczania wartości metody odniesienia, które są wymagane do kalibracji metod do mechanicznego i automatycznego oznaczania liczby komórek somatycznych. Metodą zostały objęte: definicja, zasada metody, opis odczynników, aparatura, przygotowywanie próbek do badań, oznaczanie oraz sposób obliczania i przedstawiania wyników”. Tekst normy czytamy w próbce ISO 13366-1:2008 | IDF 148-1:2008 od okładki do końca punktu 8.1.1 (strona 5); punktu 8.1.2 (barwienie bromkiem etydyny), 8.2 (liczenie), rozdziałów 9–11 (obliczenia, precyzja, sprawozdanie) ani załączników A–C nie mamy.

WEDŁUG TEKSTU ISO 13366-1:2008 (przedmowy, rozdziały 1–8.1.1). Normę przygotowały ISO/TC 34/SC 5 (mleko i przetwory mleczne) i Międzynarodowa Federacja Mleczarska (IDF). Wydanie drugie jest rewizją techniczną ISO 13366-1:1997 i zastępuje też IDF 148A:1995; część 2 serii to wytyczne do liczników fluoro-opto-elektronicznych. Zakres: metoda mikroskopowa (odniesienia) dla mleka surowego i konserwowanego chemicznie; stosuje się ją do mleka krowiego, o ile spełnione są podane warunki; nadaje się do przygotowania próbek wzorcowych i wartości odniesienia potrzebnych do kalibracji metod zmechanizowanych i automatycznych. Definicja (2.1): komórki somatyczne to komórki z jądrem, czyli wszystkie leukocyty i komórki nabłonka, oznaczone według tej normy. Zasada (3): porcję mleka rozprowadza się na szkiełku w rozmaz, suszy, komórki barwi, liczy pod mikroskopem; liczbę komórek z określonej powierzchni mnoży się przez współczynnik roboczy i otrzymuje liczbę komórek w mililitrze. Barwniki (4.1, z ostrzeżeniem: tetrachloroetan jest trujący, bromek etydyny mutagenny — przygotowanie i barwienie pod wyciągiem): zmodyfikowany roztwór Newmana-Lamperta (wariant Levowitza-Webera) — etanol 95 % 54,0 ml, tetrachloroetan 40,0 ml (zamiennie ksylen w tej samej objętości), błękit metylenowy 0,6 g, kwas octowy lodowaty 6,0 ml; mieszaninę ogrzewa się w łaźni w 65 °C, chłodzi do 4 °C, dodaje kwas, sączy i sączy ponownie przed użyciem. Bromek etydyny: roztwór podstawowy 0,25 g w 100 ml wody (do dwóch miesięcy w ciemności w 2 °C ± 2 °C), bufor z wodoroftalanu potasu 0,51 g i wodorotlenku potasu 0,162 g w 100 ml, roztwór roboczy 2 ml podstawowego + 8 ml buforu + 0,1 ml Tritonu X-100 + 90 ml wody, sporządzany bezpośrednio przed użyciem. Bufor fosforanowy PBS (4.2): NaCl 8 g, KCl 0,2 g, Na₂HPO₄·7H₂O 1,15 g, KH₂PO₄ 0,2 g w 1000 ml, pH 7,2 ± 0,1 (można użyć handlowego). Aparatura (5): łaźnie 40, 50 i 65 °C (± 2 °C); filtr 10–12 µm; mikroskop o powiększeniu 500–1000× (przy bromku etydyny — z fluorescencją); mikrostrzykawka 0,01 ml z tolerancją nie większą niż 2 %; mikrometr ze świadectwem; szkiełka z polem 1 cm² ± 5 % (95–105 mm²) prostokątnym lub okrągłym albo szablon 20 mm × 5 mm lub o średnicy 11,28 mm; wewnętrzne szerokości pola (górna i dolna) oraz wysokości (lewa i prawa), a przy polu okrągłym średnice pionowa i pozioma nie powinny różnić się o więcej niż 0,2 mm. Pobieranie (6) nie jest częścią metody — zalecana ISO 707 | IDF 50. Przechowywanie (7.1): 4 °C ± 2 °C i badanie w ciągu 6 h od pobrania; przy dłuższym przechowywaniu konserwant — kwas borowy najwyżej 0,6 g, bronopol najwyżej 0,05 g, dichromian potasu najwyżej 0,1 g na 100 ml próbki — i przechowywanie w 4 °C ± 2 °C najwyżej 6 dni. Przygotowanie (7.2): ogrzać w łaźni 40 °C, wymieszać, schłodzić do temperatury wzorcowania mikrostrzykawki (np. 20 °C); próbki powyżej 1 000 000 komórek/ml rozcieńcza się buforem do około 500 000 komórek/ml (w tekście ISO 13366-1:2008 współczynnik ma postać d = Vs/(Vs × Vb) — w mianowniku znak mnożenia, choć dla współczynnika rozcieńczenia oczekiwalibyśmy sumy Vs + Vb; czy zmienia to poprawka AC:2009, nie sprawdzaliśmy; zapisać d, Vs i Vb). Oznaczenie (8): co najmniej dwa rozmazy na próbkę, liczy się lepszy; szkiełka zanurza się w etanolu 95 %, opala i studzi; barwienie według 8.1.1 albo 8.1.2 (mleko kozie — załącznik B). Według 8.1.1: 0,01 ml próbki mikrostrzykawką na pole 1 cm², rozprowadzić igłą równo po całym polu, także przy brzegu, wysuszyć w temperaturze pokojowej, zanurzyć w roztworze Newmana-Lamperta na co najmniej 15 min, wysuszyć, delikatnie spłukać wodą wodociągową, wysuszyć i chronić przed kurzem.

STATUS (stan kart na 02.10.2026). Karta PN-EN ISO 13366-1:2009 (wersja polska, publikacja 17-02-2009, 21 stron, grupa cenowa L) nie ma nagłówka „Wycofana”: Sektor Żywności, Rolnictwa i Leśnictwa, KT 35 Mleka i Przetworów Mlecznych, ICS 67.100.10, „Wprowadza: EN ISO 13366-1:2008 [IDT], ISO 13366-1:2008 [IDT]”, „Zastępuje: PN-EN ISO 13366-1:2008 – wersja angielska”, elementy dodatkowe: PN-EN ISO 13366-1:2009/AC:2009 i PN-EN ISO 13366-1:2009/Ap1:2009. Karta wersji angielskiej PN-EN ISO 13366-1:2008 ma nagłówek „Wycofana” (data wycofania 17-02-2009, zastąpiona przez wersję polską z 2009 r.). Wyszukiwarka PKN pod hasłem „PN-EN ISO 13366-1” (02.10.2026) pokazuje też PN-EN ISO 13366-1:2000 (wersja polska).

ILE LABORATORIÓW I W JAKIEJ POSTACI (kopia bazy zakresów akredytacji, wsad do 17.09.2026, odczyt 02.10.2026). Numer 13366-1 stoi w 7 rekordach u 7 laboratoriów: AB 485, AB 545, AB 546, AB 585, AB 604, AB 620, AB 685. W aktualnych zakresach na stronach PCA (odczyt 02.10.2026, wydania od 14.10.2025 do 19.08.2026) wszystkie podają wydanie 2009 razem z poprawkami: AC:2009 i Ap1:2009 (AB 545, AB 546, AB 585, AB 604, AB 620, AB 685 — w różnej kolejności, AB 685 w trzech osobnych wierszach) albo tylko AC:2009 (AB 485). Zakładka „Laboratoria” szuka zapisów ZACZYNAJĄCYCH SIĘ od „PN-EN ISO 13366-1” i pokazuje wszystkie 7 laboratoriów — sprawdzone zapytaniem zakładki na serwerze produkcyjnym labcoda.pl 02.10.2026.

CO BADAJĄ LABORATORIA (pozycje w PCA). Zawsze „Mleko surowe” („Mleko surowe krowie” u AB 604, „Mleko” u AB 485) — „Liczba komórek somatycznych, metoda mikroskopowa”. Zakres podają dwa laboratoria: AB 485 od 100 000 do 2 000 000 komórek/ml, AB 685 od 10 000 komórek/ml; pozostałe pięć — bez zakresu. AB 485 ma obok tę samą cechę według części 2 (PN-EN ISO 13366-2:2007, metoda fluorooptoelektroniczna, od 1000 do 1 000 000 komórek/ml) — to układ, do którego metoda mikroskopowa jest odniesieniem.

GDZIE ŁATWO O WYNIK POZORNIE POPRAWNY. Przy pobraniu i przechowaniu: próbka bez konserwantu ma być zbadana w ciągu 6 h, a konserwowana — najwyżej 6 dni w 4 °C ± 2 °C; norma podaje górne granice konserwantów (kwas borowy 0,6 g, bronopol 0,05 g, dichromian potasu 0,1 g na 100 ml) i czasu przechowywania — wynik z próbki poza tymi granicami nie spełnia warunków metody, choć sam w sobie wygląda zwyczajnie. Przy pomiarze: objętość 0,01 ml dozuje mikrostrzykawka o tolerancji 2 %, a norma każe schłodzić próbkę do temperatury, w której mikrostrzykawkę wzorcowano (7.2) — pominięcie tego kroku zmienia dozowaną objętość, od której zależy przeliczenie na mililitr; pole szkiełka ma 1 cm² ± 5 %, a jego przeciwległe wymiary (szerokości, wysokości albo średnice) nie powinny różnić się o więcej niż 0,2 mm — szkiełko o innym polu wymaga przeliczenia współczynnika roboczego; mleko trzeba rozprowadzić także przy brzegu pola. Przy obliczeniu: próbkę powyżej 1 000 000 komórek/ml rozcieńcza się buforem do około 500 000 komórek/ml i zapisuje d, Vs i Vb, a wzór na d sprawdza w wydaniu z poprawką AC:2009 (w tekście ISO 13366-1:2008 w mianowniku stoi Vs × Vb) — rozcieńczenie trzeba uwzględnić w obliczeniu według rozdziału 9, którego nie mamy. Przy roli metody: jest metodą odniesienia dla liczników automatycznych (osobny wpis o PN-EN ISO 13366-2) — wartości z mikroskopu służą do ich kalibracji, a nie odwrotnie. Przy zakresie: AB 685 podaje zakres od 10 000 komórek/ml, AB 485 od 100 000 komórek/ml; granic oznaczalności sama norma w czytanym fragmencie nie podaje.

CZEGO NIE PODAJEMY. Nie mamy punktów 8.1.2 i 8.2 ani rozdziałów 9–11: sposobu barwienia bromkiem etydyny krok po kroku, liczby pól lub pasm do policzenia, wzorów na współczynnik roboczy (prostokąt — pola kolejne lub pasma, koło — pola kolejne), granic powtarzalności i odtwarzalności ani zawartości sprawozdania; nie mamy też załączników A (badanie międzylaboratoryjne), B (barwienie mleka koziego) i C (rozkład Poissona). Nie podajemy więc żadnej liczby precyzji ani minimalnej liczby komórek do policzenia.

Zasada metody

0,01 ml mleka (rozcieńczonego buforem, gdy liczba komórek przekracza 1 000 000/ml) rozprowadza się na polu 1 cm² szkiełka, suszy i barwi (Newman-Lampert albo bromek etydyny); komórki z jądrem liczy się pod mikroskopem w określonej powierzchni i mnoży przez współczynnik roboczy, otrzymując liczbę komórek w mililitrze.

Zastosowania

• Mleko surowe — liczba komórek somatycznych metodą mikroskopową; 7 laboratoriów w zakresach PCA
• Wartości odniesienia i próbki wzorcowe do kalibracji liczników automatycznych (PN-EN ISO 13366-2)
• Mleko konserwowane chemicznie (kwas borowy, bronopol, dichromian potasu) przechowywane najwyżej 6 dni

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 13366-1:2009 (wersja polska; EN ISO 13366-1:2008 IDT, ISO 13366-1:2008 IDT) z PN-EN ISO 13366-1:2009/AC:2009 i PN-EN ISO 13366-1:2009/Ap1:2009

Tytuł (PL)

Mleko — Oznaczanie liczby komórek somatycznych — Część 1: Metoda mikroskopowa (Metoda odniesienia)

Title (EN)

Milk — Enumeration of somatic cells — Part 1: Microscopic method (Reference method)

Procedura krok po kroku

1. Próbka

   Przechowywać w 4 °C ± 2 °C; badać w ciągu 6 h albo dodać konserwant i badać najwyżej po 6 dniach. PN-EN ISO 13366-1:2009 aktualna (stan kart na 02.10.2026).

2. Przygotowanie

   Ogrzać w łaźni 40 °C, wymieszać, schłodzić do temperatury wzorcowania mikrostrzykawki; próbki > 1 000 000 komórek/ml rozcieńczyć buforem do ok. 500 000/ml i zapisać d, Vs, Vb.

3. Rozmaz

   Co najmniej dwa rozmazy: 0,01 ml na pole 1 cm² odtłuszczonego (etanol 95 %, opalenie) szkiełka, równo po całym polu także przy brzegu; wysuszyć w temperaturze pokojowej.

4. Barwienie

   Roztwór Newmana-Lamperta co najmniej 15 min, suszenie, spłukanie wodą wodociągową, suszenie (8.1.1); albo bromek etydyny według 8.1.2 (tego punktu nie mamy).

5. Liczenie i wynik

   Liczyć komórki pod mikroskopem w lepszym rozmazie i przeliczyć współczynnikiem roboczym na komórki/ml według rozdziału 9 (wzorów nie mamy).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Tetrachloroetan jest trujący, a bromek etydyny mutagenny — przygotowanie roztworów i barwienie pod wyciągiem, w środkach ochrony; rozlania dezaktywować (4.1)
• Dichromian potasu jako konserwant zaleca się ograniczać do próbek wymagających długiego przechowywania (7.1)
• UWAGA MERYTORYCZNA: to metoda odniesienia do kalibracji liczników automatycznych; próbka bez konserwantu — w ciągu 6 h, z konserwantem — najwyżej 6 dni w 4 °C ± 2 °C

Najczęstsze pytania