🔴 Legionella w wodzie
Wykrywanie i oznaczanie ilościowe bakterii z rodzaju Legionella w wodzie metodą hodowlaną na podłożu BCYE/GVPC z obróbką termiczną lub kwasową. Jedyna metoda uznawana przez Sanepid.
Przegląd
Legionella to rodzaj Gram-ujemnych pałeczek, z których najgroźniejsza dla człowieka jest Legionella pneumophila — sprawca legionellozy (choroby legionistów), ciężkiego zapalenia płuc o śmiertelności 5–30%. Bakterie Legionella bytują naturalnie w środowisku wodnym, ale stwarzają zagrożenie zdrowotne, gdy namnażają się w sztucznych systemach wodnych: instalacjach ciepłej wody użytkowej, wieżach chłodniczych, fontannach, jacuzzi, nawilżaczach i klimatyzatorach.
Zakażenie następuje drogą wziewną — przez wdychanie aerozolu wodnego zawierającego bakterie. Legionella nie przenosi się z człowieka na człowieka. Optymalna temperatura namnażania: 25–45°C, z maksimum w 35–37°C. Poniżej 20°C bakterie nie rosną, powyżej 60°C giną.
Metoda hodowlana według PN-EN ISO 11731:2017 jest jedyną metodą uznawaną przez Państwową Inspekcję Sanitarną w Polsce. Obejmuje filtrację membranową lub bezpośredni posiew, obróbkę wstępną próbki (termiczna 50°C/30 min lub kwasowa pH 2,2/5 min) w celu eliminacji flory towarzyszącej, hodowlę na podłożu GVPC (selektywnym) i BCYE (nieselektywnym) w temperaturze 36±1°C w atmosferze wilgotnej przez 7–10 dni.
Badanie jest wymagane przez Rozporządzenie Ministra Zdrowia w sprawie jakości wody w instalacjach wewnętrznych (≤100 jtk/100 mL — bez działań, >100 — czyszczenie i dezynfekcja, >1000 — natychmiastowe działania korygujące). Okres oczekiwania na wynik: 9–15 dni, co jest główną wadą metody hodowlanej.
Zasada metody
Próbkę wody zagęszcza się przez filtrację membranową (0,2 µm) lub odwirowywanie. Koncentrat poddaje się obróbce eliminującej florę towarzyszącą: termicznej (50±1°C/30 min) lub kwasowej (bufor HCl/KCl pH 2,2 przez 5 min). Próbkę wysiewa się na podłoże GVPC (agar BCYE z suplementami: glicyna, polimyksyna B, wankomycyna, cykloheksimid — hamujące bakterie i grzyby) oraz na podłoże BCYE bez suplementów (kontrola). Inkubacja: 36±1°C w atmosferze wilgotnej (>80% RH) przez 7–10 dni. Kolonie Legionella: szarawe, szkliste, o „przeciętym szkle" (cut-glass) strukturze. Potwierdzenie: brak wzrostu na BCYE bez L-cysteiny (Legionella wymaga L-cysteiny do wzrostu).
Zastosowania
- Monitoring instalacji ciepłej wody użytkowej (szpitale, hotele, budynki wielorodzinne)
- Kontrola wież chłodniczych i systemów klimatyzacyjnych
- Badanie wody w basenach, jacuzzi, SPA, fontannach
- Dochodzenie epidemiologiczne — ogniska legionellozy
- Kontrola skuteczności dezynfekcji termicznej (>70°C) i chemicznej
- Monitoring wody w obiektach opieki zdrowotnej (obowiązkowy)
- Badanie wody na zlecenie zarządców nieruchomości
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Wynik | jtk/100 mL (jednostki tworzące kolonie) |
| Wartość dopuszczalna | ≤100 jtk/100 mL (bez działań), >1000 — alarm |
| Temperatura inkubacji | 36 ± 1°C |
| Czas inkubacji | 7–10 dni (odczyt po 3, 5, 7 i 10 dniach) |
| Atmosfera | Tlenowa, wilgotność >80% RH |
| Czas oczekiwania na wynik | 9–15 dni (z obróbką i potwierdzeniem) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 11731:2017
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Legionella
- Title (EN)
- Water quality — Enumeration of Legionella
Procedura krok po kroku
1. Pobieranie próbki
Pobierz min. 1 L wody. NIE płucz punktu poboru (bez spłukiwania). Dodaj tiosiarczan sodu (jeśli woda chlorowana). Transportuj w 5–20°C, analiza do 24 h.
2. Filtracja membranowa — zagęszczenie
Przefiltruj 1 L próbki przez sączek 0,2 µm (poliwęglanowy). Aseptycznie wytnij membranę, umieść w sterylnym pojemniku z 10 mL oszczędzonej próbki. Vortexuj energicznie 2 min.
3. Obróbka termiczna
Podziel zagęszczoną próbkę na 2 porcje. Jedną ogrzej w łaźni wodnej 50±1°C przez 30 min (eliminacja flory wrażliwej na ciepło). Drugą pozostaw bez obróbki.
4. Obróbka kwasowa (alternatywa)
Zamiast obróbki termicznej: dodaj bufor HCl/KCl (pH 2,2) w proporcji 1:1. Kontakt 5 min. Następnie zneutralizuj buforem KOH.
5. Posiew na podłoża
Wysiij po 0,1 mL próbki (obrobionej i nieobrobionej) na płytki GVPC i BCYE. Rozsmaruj szpatułką szklaną. Wysiij w duplikacie.
6. Inkubacja
Inkubuj płytki w 36±1°C w atmosferze wilgotnej (>80% RH). Stosuj szczelnie zamknięte worki lub inkubator z tacką wodną. NIE odwracaj płytek.
7. Odczyt — dzień 3 i 5
Sprawdź płytki pod mikroskopem stereoskopowym. Jeśli flora towarzysząca zarasta płytki GVPC — wykonaj dodatkowy posiew z kolejną obróbką.
8. Odczyt — dzień 7 i 10
Policz kolonie o typowej morfologii: szarawe, szkliste, połyskujące, o strukturze „przeciętego szkła". Średnica 1–3 mm. Oznacz podejrzane kolonie.
9. Potwierdzenie — subkultura
Przenieś podejrzane kolonie na BCYE z L-cysteiną i BCYE bez L-cysteiny. Inkubuj 36°C/48 h. Wzrost na BCYE+cysteina i brak wzrostu na BCYE−cysteina = Legionella spp.
10. Identyfikacja serogrup
Potwierdzone kolonie Legionella testuj testem lateksowym (aglutynacja) do identyfikacji L. pneumophila sg 1 (najczęściej patogenna) i sg 2–14.
11. Obliczenie wyniku
Wynik = (liczba potwierdzonych kolonii × współczynnik rozcieńczenia) / objętość próbki. Podaj w jtk/100 mL lub jtk/L.
12. Kontrola jakości
Kontrola pozytywna: L. pneumophila ATCC 33152. Kontrola negatywna: sterylna woda. Sprawdź wilgotność inkubatora i sterylność podłoży.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| System filtracji membranowej (0,2 µm) | Sartorius Combisart, Merck EZ-Fit z sączkami 0,2 µm | 3 000–12 000 PLN |
| Inkubator z kontrolą wilgotności | Binder KBF 115, Memmert HPP110 z tacką wodną | 8 000–25 000 PLN |
| Łaźnia wodna z termostatem | Memmert WNB 14, Julabo CORIO C-B5 (50°C dla obróbki termicznej) | 5 000–15 000 PLN |
| Vortex laboratoryjny | IKA Vortex 3, Scientific Industries Vortex-Genie 2 | 1 500–4 000 PLN |
| Autoklaw | Tuttnauer ELV 2540 | 20 000–45 000 PLN |
| Komora laminarna klasy II | Esco Airstream Class II, Telstar Bio II Advance | 20 000–50 000 PLN |
| Mikroskop stereoskopowy | Zeiss Stemi 305, Olympus SZ61 | 5 000–15 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| BCYE Agar (Buffered Charcoal Yeast Extract) | — | Podłoże podstawowe z L-cysteiną, pirofosforanem żelazowym, węglem aktywnym, ekstraktem drożdżowym, buforem ACES. Producenci: Oxoid, Merck, bioMérieux |
| GVPC Agar (suplement selektywny) | — | BCYE + glicyna + polimyksyna B + wankomycyna + cykloheksimid. Hamuje florę towarzyszącą |
| BCYE bez L-cysteiny | — | Podłoże kontrolne — Legionella nie rośnie bez L-cysteiny. Do potwierdzenia |
| L-Cysteina chlorowodorek | 52-89-1 | Suplement wzrostowy BCYE, stężenie 0,4 g/L. Legionella wymaga L-cysteiny |
| Bufor kwasowy HCl/KCl pH 2,2 | — | Do obróbki kwasowej próbki — eliminacja flory towarzyszącej. Kontakt 5 min |
| Sączki membranowe 0,2 µm (poliwęglanowe) | — | Poliwęglan (PC), 47 mm, czarne lub białe. Do filtracji próbek Legionella |
| Odczynniki do testu lateksowego | — | Test aglutynacji lateksowej do identyfikacji serogrup L. pneumophila (sg 1–14). Oxoid DR0800 |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Legionella pneumophila — patogen BSL-2! Wszystkie prace w komorze laminarnej klasy II. Maska FFP2/FFP3 przy pracy z aerozolem
- NIE vortexować otwartych probówek z próbką — ryzyko tworzenia zakaźnego aerozolu
- Bufor kwasowy pH 2,2 — żrący, stosować rękawice i okulary ochronne
- Cykloheksimid (w GVPC) — toksyczny, mutagenny. Unikać kontaktu, pracować w wyciągu
- Materiał zakaźny — autoklaw 121°C/30 min. Płytki pakować do worków autoklawowalnych
- Próbki wody z instalacji >40°C — ryzyko oparzenia przy pobieraniu