🦠 Komórki somatyczne w mleku surowym — liczniki fluoro-opto-elektroniczne (cytometria dyskowa lub przepływowa)

Mikrobiologia PN-EN ISO 13366-2

Przegląd

ISO 13366-2 | IDF 148-2:2006 podaje wytyczne warunków pracy przy liczeniu komórek somatycznych w mleku surowym i konserwowanym chemicznie licznikami fluoro-opto-elektronicznymi, w których w sekcji liczącej stosuje się technikę wirującego dysku albo cytometrię przepływową; dotyczy mleka krowiego, a także koziego, owczego i bawolego, jeśli spełnione są określone warunki wstępne. Wydanie zastąpiło ISO 13366-2:1997 i ISO 13366-3:1997 oraz IDF 148A:1995 (metody B i C). Komórki somatyczne definiuje się jako komórki wykazujące fluorescencję powyżej progu wskutek wybarwienia DNA w jądrach; liczbę wyraża się w komórkach na ml. Metodą odniesienia jest metoda mikroskopowa ISO 13366-1 | IDF 148-1; kalibracja i kontrola jakości opierają się na ISO 8196-1/-2 (dokładność metod pośrednich), materiałach odniesienia (ISO Guide 34) i badaniach biegłości (ISO Guide 43-1). Rozporządzenie (WE) nr 853/2004 (załącznik III, sekcja IX) ustala dla surowego mleka krowiego kryterium liczby komórek somatycznych ≤ 400 000/ml (średnia geometryczna krocząca) obok liczby bakterii w 30 °C ≤ 100 000/ml, dopuszczając odstępstwa za zgodą organów dla niektórych serów. Aparaty takie jak Fossomatic (FOSS) deklarują zgodność z ISO 13366-2 / IDF 148-2:2006 i certyfikację MicroVal dla liczenia komórek somatycznych w surowym mleku krowim.

Zasada metody

Liczniki fluoro-opto-elektroniczne mają funkcje poboru odczynników i próbki, sekcję mieszania i sekcję liczącą. W sekcji mieszania ściśle kontrolowane objętości próbki oraz roztworu buforu i barwnika są dozowane i mieszane (w kubeczku, komorze, wirówce, pętli próbki lub przewodzie do celi przepływowej); część mieszaniny trafia na płaszczyznę obiektu w sekcji liczącej. Każda wybarwiona cząstka obserwowana mikroskopem fluorescencyjnym wytwarza impuls elektryczny, który jest filtrowany, wzmacniany i rejestrowany; rozkład wysokości impulsów jest przetwarzany elektronicznie z rozróżnieniem szumu od impulsów przypisanych komórkom — próg dyskryminacji może być stały lub dynamiczny. W cytometrii dyskowej cienki film mieszaniny nanoszony jest dyszą na szczyt pionowego wirującego dysku, który stanowi ruchomą płaszczyznę obiektu; w cytometrii przepływowej część mieszaniny wprowadza się w szybki strumień cieczy osłonowej w kapilarnej celi przepływowej, gdzie po przyspieszeniu tworzy cienką nić z dynamicznie ogniskowanymi komórkami przechodzącą przed obiektywem. Aparaty dwukanałowe traktuje się jak dwa osobne urządzenia. Wynik = zliczona liczba × współczynnik roboczy (niższy współczynnik sprzyja precyzji); istotny jest stosunek objętości buforu/barwnika do próbki. Czynniki wpływające na wynik: butelki (szczelne, właściwa pusta objętość — za duża sprzyja zmaślaniu, za mała utrudnia mieszanie), pobieranie (dokładne mieszanie mleka zbiorczego — komórki gromadzą się w warstwach górnej i dolnej; przy próbkach od pojedynczych zwierząt reprezentatywna próbka całego udoju), chłodzenie 0–6 °C bez zamrażania, liczenie do 96 h (zamrożenie i rozmrożenie obniża wynik o 10–20 %), konserwacja w ciągu 24 h (kwas borowy ≤ 0,6 g/100 ml — 24 h w 6–12 °C; azydek sodu ≤ 0,024 g/100 ml — 72 h w 2–10 °C; bronopol ≤ 0,05 g/100 ml — 6 dni w 2–12 °C; dichromian potasu ≤ 0,2 g/100 ml — 6 dni w 2–12 °C; znaczniki barwne: Patent Blue V ≤ 0,15 mg/100 ml, Yellow Orange S ≤ 1 mg/100 ml, mieszanina Patent Blue V + Eosin B), substancje zakłócające (konserwanty i znaczniki powyżej limitów, błękit metylenowy > 0,06 mg/100 ml), liza komórek (przesunięcie rozkładu impulsów w lewo — zaniżenie), próbki problematyczne (mleko z ostrego zapalenia wymienia ze skrzepami, zanieczyszczone, z dużą liczbą erytrocytów, siara, mleko z końca laktacji, mleko kwaśne), stan aparatu (mieszadło, drożność toru, źródło światła i fotopowielacz; w dyskowych — położenie filmu, czystość płaszczyzny obiektu i gąbki czyszczącej; w przepływowych — zachowanie nici próbki i przepływ cieczy osłonowej). Odczynniki jakości analitycznej i bakteriologicznej, woda demineralizowana < 10 µS/cm.

Zastosowania

• Rutynowa ocena mleka surowego w laboratoriach oceny mleka (skup) — kryterium ≤ 400 000 komórek/ml wg rozp. (WE) 853/2004
• Ocena wartości użytkowej krów mlecznych — próbki od pojedynczych zwierząt (diagnostyka stanu wymienia, mastitis)
• Mleko kozie, owcze i bawole po spełnieniu warunków wstępnych normy
• Laboratoria mleczarni — kontrola surowca przy odbiorze; łączenie z analizatorami składu (CombiFoss) z uwzględnieniem wpływu konserwantów
• Badania biegłości i kalibracja wobec metody mikroskopowej ISO 13366-1

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 13366-2:2007 (ISO 13366-2:2006 | IDF 148-2:2006)

Tytuł (PL)

Mleko — Oznaczanie liczby komórek somatycznych — Część 2: Przewodnik obsługi liczników fluoro-opto-elektronicznych

Title (EN)

Milk — Enumeration of somatic cells — Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters

Procedura krok po kroku

1. Pobieranie

   Użyj czystych, suchych, szczelnych butelek z właściwą pustą objętością; mleko zbiorcze dokładnie wymieszaj (komórki gromadzą się w warstwach górnej i dolnej); od pojedynczych zwierząt pobierz reprezentatywną próbkę całego udoju (diagnostycznie — z części udoju).

2. Chłodzenie lub konserwacja

   Schłodź próbki od razu do 0–6 °C i nie zamrażaj; licz w ciągu 96 h. Jeśli konieczna jest konserwacja — dodaj konserwant w ciągu 24 h w dopuszczalnym stężeniu (kwas borowy, azydek, bronopol lub dichromian) z ewentualnym znacznikiem barwnym i przechowuj w podanych warunkach; sprawdź brak interferencji dla używanego aparatu.

3. Kontrola aparatu

   Sprawdź mieszadło, drożność toru (skrzepy, zanieczyszczenia, osady), źródło światła, fotopowielacz i wzmocnienie; w licznikach dyskowych — położenie filmu, czystość płaszczyzny obiektu i wymianę gąbki, opróżnianie naczynia na ciecz płuczącą; w przepływowych — zachowanie nici próbki i przepływ cieczy osłonowej.

4. Kalibracja

   Skalibruj wobec metody mikroskopowej ISO 13366-1 z użyciem materiałów odniesienia (CRM niedostępne; IRM przygotowane z zawiesiny leukocytów lub przez mikrofiltrację mleka, 5–8 poziomów) zgodnie z ISO 8196-1/-2; oceń każdy kanał aparatu dwukanałowego osobno.

5. Pomiar

   Aparat dozuje i miesza próbkę z buforem/barwnikiem, nanosi mieszaninę na dysk lub do celi przepływowej i zlicza impulsy powyżej progu; unikaj próbek problematycznych (skrzepy, siara, mleko kwaśne), a po nich sprawdź i wyczyść tor przepływu.

6. Wynik

   Podaj liczbę komórek somatycznych na ml (zliczenie × współczynnik roboczy); dla oceny prawnej mleka surowego oblicz średnią geometryczną kroczącą i porównaj z 400 000/ml; uczestnicz w badaniach biegłości (ISO Guide 43-1).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Azydek sodu i dichromian potasu (konserwanty) — toksyczne; azydek tworzy wybuchowe azydki metali w instalacjach kanalizacyjnych; dichromian — rakotwórczy
• Barwniki fluorescencyjne wiążące DNA — mutagenne, rękawice; odpady odczynników wg przepisów lokalnych
• Surowe mleko może zawierać patogeny (Listeria, Salmonella, gronkowce) — higiena pracy

Najczęstsze pytania