🦠 Kolifagi somatyczne w wodzie — metoda łysinkowa z dwiema warstwami agaru i szczepem gospodarzem E. coli

Mikrobiologia PN-EN ISO 10705-2

Przegląd

Kolifagi somatyczne to wirusy bakteryjne zakażające wybrane szczepy Escherichia coli (i szczepy pokrewne) przez przyłączenie się do ściany komórkowej jako pierwszy krok zakażenia. W zwartym naroście bakterii gospodarza dają widoczne łysinki — strefy przejaśnienia. Są bardziej oporne na dezynfekcję niż bakterie wskaźnikowe i przeżywają w znacznej odległości od źródła zanieczyszczenia, dlatego traktuje się je jako wskaźnik obecności wirusów jelitowych i narzędzie oceny skuteczności usuwania wirusów w procesach uzdatniania.

Norma opisuje wykrywanie i oznaczanie liczby kolifagów somatycznych przez inkubację próbki z odpowiednim szczepem gospodarzem. Jest stosowana do wszystkich rodzajów wód, do osadów i wyciągów z osadów ściekowych (w razie potrzeby po rozcieńczeniu), a także do wyciągów z mięczaków. Przy małej liczbie fagów potrzebny jest etap wstępnego zatężania próbki — norma (z 2000 r.) zapowiada w zakresie osobny dokument na ten temat, a w przedmowie wymienia część 3 serii, „Concentration methods"; rozporządzenie Ministra Zdrowia dopuszcza do tego celu PN-EN ISO 10705-3.

W Polsce kolifagi somatyczne weszły do przepisów jako parametr operacyjny. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 22 maja 2026 r. (Dz. U. z 2026 r. poz. 748) dopuszcza do ich oznaczania normy PN-EN ISO 10705-2 i PN-EN ISO 10705-3, a w załączniku nr 7 tabela 2 ustala wartość odniesienia 50 pfu/100 ml dla wody surowej: przekroczenie tej wartości zobowiązuje do wykonania analizy po kolejnych etapach uzdatniania, aby wyznaczyć logarytmiczną wartość usuwania i ocenić, czy ryzyko przedostania się wirusów chorobotwórczych jest opanowane. Opis w tym wpisie pochodzi z tekstu ISO 10705-2:2000 — wydania pierwszego i jedynego, potwierdzonego przez ISO w przeglądzie systematycznym 5 sierpnia 2021 r.; kolejny przegląd rozpoczął się 15 lipca 2026 r. i jeszcze się nie zakończył. Polskie przyjęcie tej normy (PN-EN ISO 10705-2, wprowadzające EN ISO 10705-2) przywołujemy bez roku wydania: karty katalogowej PKN nie udało się sprawdzić, bo sklep PKN był w czasie opracowania niedostępny; w publikacjach laboratoryjnych pojawia się oznaczenie z rokiem 2005, ale nie zostało ono potwierdzone w katalogu. Badania NIZP–PZH wykonane wg PN-EN ISO 10705-2 wykazały kolifagi somatyczne w 8 % próbek wody surowej z ujęć podziemnych i w 89 % próbek z ujęć powierzchniowych, przy czym w żadnej próbce wody uzdatnionej ich nie stwierdzono.

TYTUŁ POLSKI W TYM WPISIE TO NASZE TŁUMACZENIE ROBOCZE, nie tytuł urzędowy: tytułu nie potwierdzono na karcie PKN, sklep był niedostępny; w rozporządzeniu MZ używa się pisowni „colifagi somatyczne".

Zasada metody

Próbkę miesza się z niewielką objętością półstałej pożywki wzrostowej. Dodaje się hodowlę szczepu gospodarza i całość wylewa na pożywkę stałą. Następnie prowadzi się inkubację i odczytuje płytki, licząc widoczne łysinki. Wynik wyraża się jako liczbę cząstek tworzących łysinki — pfp, nazywanych też jednostkami tworzącymi łysinki, pfu — przypadającą na jednostkę objętości próbki. Dobór szczepu gospodarza zależy od zanieczyszczenia bakteryjnego próbki: dla wód o małej zawartości bakterii stosuje się E. coli szczep C, dla wód silnie zanieczyszczonych i ścieków — mutanta opornego na kwas nalidyksowy, co pozwala stłumić tło bakteryjne próbki.

Zastosowania

• Monitoring operacyjny wody surowej wg Dz. U. 2026 poz. 748 — wartość odniesienia 50 pfu/100 ml
• Ocena skuteczności uzdatniania wody pod kątem usuwania wirusów jelitowych (wartość logarytmiczna usuwania po kolejnych barierach)
• Wody powierzchniowe i podziemne ujmowane przez wodociągi
• Ścieki i wody silnie zanieczyszczone — z użyciem szczepu gospodarza opornego na kwas nalidyksowy
• Osady i wyciągi z osadów ściekowych (w razie potrzeby po rozcieńczeniu)
• Wyciągi z mięczaków — norma wymienia je wprost w zakresie

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 10705-2:2005 (EN ISO 10705-2:2001 [IDT], ISO 10705-2:2000 [IDT]; zastępuje PN-EN ISO 10705-2:2002 — wersję angielską)

Tytuł (PL)

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe bakteriofagów — Część 2: Oznaczanie ilościowe colifagów somatycznych

Title (EN)

Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages — Part 2: Enumeration of somatic coliphages

Procedura krok po kroku

1. Pobranie i transport próbki

   Próbki pobierać i dostarczać do laboratorium zgodnie z ISO 8199 oraz ISO 5667-1, -2 i -3. W praktyce NIZP–PZH próbki pobierano do jałowych butelek polipropylenowych z dodatkiem tiosiarczanu sodu wg PN-EN ISO 19458, przewożono w chłodzie i przechowywano w 5 ± 3 °C nie dłużej niż 48 h do czasu badania.

   🌡 Temperatura: 5 ± 3 °C

2. Wybór szczepu gospodarza

   Dla próbek o małej zawartości bakterii (woda do picia, niezanieczyszczone wody naturalne) użyć E. coli szczep C, ATCC 13706. Dla próbek z dużą liczbą bakterii (zanieczyszczone wody naturalne, ścieki) użyć mutanta opornego na kwas nalidyksowy, E. coli szczep CN, ATCC 700078 (WG5).

3. Hodowla podstawowa szczepu gospodarza

   Zawartość liofilizowanej ampułki szczepu odniesienia odtworzyć w ok. 3 ml bulionu MSB pipetą Pasteura, przenieść do kolby stożkowej 300 ml zawierającej (50 ± 5) ml MSB i inkubować przy łagodnym wytrząsaniu. Dodać 10 ml sterylnej gliceryny (stężenie końcowe 15–20 % obj.), wymieszać, rozlać po ok. 0,5 ml do fiolek i przechowywać w (−70 ± 10) °C lub w ciekłym azocie.

   ⏱ Czas: (20 ± 4) h • 🌡 Temperatura: (36 ± 2) °C

4. Hodowle robocze i wytrząsanie

   Hodowle na kolejnych etapach prowadzić przy łagodnym wytrząsaniu — poza szybszym wzrostem zapewnia to, że wszystkie komórki są w fazie wzrostu i nie pojawiają się komórki fazy stacjonarnej, które obniżają wydajność wysiewu. Bez wytrząsarki hodowle inokulacyjne wytrząsać wielokrotnie ręcznie.

5. Kalibracja pomiaru gęstości hodowli

   Wyskalować pomiary absorbancji względem liczby żywych komórek (rozdz. 10.2 normy), używając spektrofotometru z filtrem w zakresie 500–650 nm oraz kuwet 1 cm albo kolb nefelometrycznych z bocznym ramieniem.

6. Rozcieńczenia próbki

   W razie potrzeby sporządzić rozcieńczenia próbki w roztworze peptonowo-solnym albo w innym rozcieńczalniku zgodnym z ISO 6887. Norma dopuszcza także badanie wyciągów z osadów i mięczaków po rozcieńczeniu.

7. Wysiew dwuwarstwowy

   Próbkę zmieszać z niewielką objętością półstałej pożywki wzrostowej, dodać hodowlę szczepu gospodarza i wylać na pożywkę stałą na płytce Petriego. W wyposażeniu norma wymienia łaźnię wodną lub blok grzejny nastawiony na (45 ± 1) °C oraz osobną łaźnię do roztapiania pożywek agarowych.

8. Inkubacja i odczyt

   Płytki inkubować w cieplarce lub łaźni wodnej nastawionej na (36 ± 2) °C, a następnie odczytać, licząc widoczne łysinki w zwartym naroście bakterii gospodarza. Do liczenia użyć licznika z oświetleniem pośrednim, skośnym.

   🌡 Temperatura: (36 ± 2) °C

9. Próbki o małej liczbie fagów

   Gdy spodziewana liczba fagów jest mała, konieczne jest wstępne zatężenie próbki — norma odsyła po nie do osobnego dokumentu (ISO 10705-3, w Polsce PN-EN ISO 10705-3, dopuszczonej do tego celu przez rozporządzenie). NIZP–PZH zatężał próbki 100 ml filtracją membranową na filtrach z estrów celulozy, po dodaniu chlorku magnezu do stężenia końcowego 0,05 mol/l.

10. Zapewnienie jakości i wynik

    Materiał odniesienia przygotować z bakteriofaga ΦX174, ATCC 13706-B1 (rozdz. 8 i 11.6.1 normy). Wynik wyrazić jako liczbę cząstek tworzących łysinki (pfp/pfu) na jednostkę objętości próbki; do porównania z wartością odniesienia rozporządzenia przelicza się go na 100 ml wody surowej.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Szczep gospodarz stosowany w tej normie jest niechorobotwórczy dla ludzi i zwierząt — obchodzić się z nim zgodnie ze zwykłymi procedurami bezpieczeństwa laboratorium bakteriologicznego
• Kolifagi somatyczne również nie są chorobotwórcze dla ludzi i zwierząt, ale niektóre typy są bardzo oporne na wysychanie — należy zapobiegać zanieczyszczeniom krzyżowym materiału badanego
• Pracę z hodowlami o wysokim mianie oraz zaszczepianie hodowli szczepu gospodarza prowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego albo w wydzielonej części laboratorium
• Chloroform jest substancją rakotwórczą — zachować właściwe środki ostrożności albo zastosować równie skuteczną metodę alternatywną
• Badane próbki wód powierzchniowych i ścieków zawierają florę kałową — obowiązują zwykłe zasady pracy z materiałem potencjalnie zakaźnym (rękawice, fartuch, dekontaminacja odpadów)

Najczęstsze pytania