🍎 Hydroksyprolina (kolagen) w mięsie — hydroliza w kwasie siarkowym, utlenianie chloraminą T, fotometria 558 nm

Chemia żywności PN-ISO 3496

Przegląd

Norma określa metodę oznaczania zawartości hydroksyproliny we wszystkich rodzajach mięsa i przetworów mięsnych, łącznie z drobiem, o zawartości hydroksyproliny poniżej 0,5 % (m/m). Hydroksyprolina jest aminokwasem charakterystycznym dla kolagenu, dlatego jej zawartość służy do obliczania zawartości tkanki łącznej: w badaniach mięśni wołowych oznaczoną hydroksyprolinę przelicza się na kolagen ogólny mnożnikiem 7,25. Opis oparto na podglądzie ISO 3496:1994, którą wprowadza PN-ISO 3496:2000.

Metoda składa się z hydrolizy odważki w kwasie siarkowym w 105 °C, sączenia i rozcieńczenia hydrolizatu, utlenienia hydroksyproliny chloraminą T i utworzenia czerwonego związku z p-dimetyloaminobenzaldehydem, którego absorbancję mierzy się przy 558 nm. Stężenie odczytuje się z krzywej wzorcowej sporządzanej dla każdej serii analiz z czterech roztworów wzorcowych hydroksyproliny (0,5; 1; 1,5 i 2 µg/ml).

Zawartość kolagenu ma znaczenie dla kruchości mięsa i jakości przetworów: w mięśniach wołowych zawartość kolagenu ogólnego wahała się od 0,4 % (longissimus dorsi) do 1,3 % (infraspinatus), a hydroksyprolina figuruje w wykazie oznaczeń zeszytu branżowego QAFP dla konserw.

Zasada metody

Około 4 g próbki (ważonej z dokładnością do 0,001 g) hydrolizuje się z 30 ± 1 ml kwasu siarkowego 3 mol/l w suszarce 105 °C przez 16 h (dogodnie przez noc). Gorący hydrolizat sączy się do kolby miarowej 250 ml, przemywa trzykrotnie 10 ml gorącego kwasu i uzupełnia wodą. Porcję V hydrolizatu rozcieńcza się do 250 ml tak, aby stężenie hydroksyproliny mieściło się w zakresie 0,5–2 µg/ml (zwykle V = 5–25 ml zależnie od ilości tkanki łącznej). Do 4,00 ml rozcieńczonego roztworu dodaje się 2,00 ml odczynnika chloraminy T (20 min w temperaturze pokojowej), potem 2,00 ml odczynnika barwnego z p-dimetyloaminobenzaldehydem, ogrzewa dokładnie 20 min w łaźni 60 °C, studzi i po 30 min mierzy absorbancję przy 558 ± 2 nm w kuwecie 10 mm wobec wody. Zawartość hydroksyproliny: wh = 6,25·c/(m·V) [% masy], gdzie c — stężenie z krzywej wzorcowej (µg/ml), m — masa odważki (g), V — objętość porcji hydrolizatu (ml). Wynik podaje się z dokładnością do 0,01 %.

Zastosowania

• Oznaczanie zawartości kolagenu (tkanki łącznej) w mięsie i przetworach mięsnych, w tym drobiowych
• Ocena jakości surowca mięsnego i przetworów (stosunek kolagenu do białka)
• Badania kruchości i rozpuszczalności kolagenu śródmięśniowego (kolagen ogólny = hydroksyprolina × 7,25)
• Kontrola konserw mięsnych — oznaczenie w wykazie procedur systemu QAFP

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-ISO 3496:2000

Tytuł (PL)

Mięso i przetwory mięsne — Oznaczanie zawartości hydroksyproliny

Title (EN)

Meat and meat products — Determination of hydroxyproline content

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie próbki

   Mięso surowe pokroić na zimno w kostkę o boku ok. 8 mm, zamknąć hermetycznie lub zapakować próżniowo i ogrzewać tak, aby utrzymać co najmniej 70 °C przez co najmniej 30 min (zmiękcza tkankę łączną); ostudzić i zhomogenizować w maszynce. Przetwory gotowane homogenizować bezpośrednio. Analizować w ciągu 24 h, dbając o równomierne rozprowadzenie tłuszczu i płynu.

2. Odważka

   Odważyć ok. 4 g próbki z dokładnością do 0,001 g do kolby hydrolizacyjnej; upewnić się, że materiał nie przylega do ścianek.

3. Hydroliza

   Dodać 30 ± 1 ml kwasu siarkowego 3 mol/l, przykryć szkiełkiem zegarkowym i wstawić do suszarki 105 °C na 16 h (dogodnie przez noc).

   ⏱ Czas: 16 h • 🌡 Temperatura: 105 °C

4. Sączenie i rozcieńczenie hydrolizatu

   Gorący hydrolizat przesączyć do kolby miarowej 250 ml; kolbę i sączek przemyć trzy razy porcjami po 10 ml gorącego kwasu siarkowego 3 mol/l, dodać popłuczyny, uzupełnić wodą do kreski i wymieszać.

5. Rozcieńczenie robocze

   Pipetą przenieść do kolby 250 ml objętość V hydrolizatu dobraną tak, aby po rozcieńczeniu stężenie hydroksyproliny wynosiło 0,5–2 µg/ml (najczęściej V = 5–25 ml, zależnie od ilości tkanki łącznej); uzupełnić wodą.

6. Utlenianie chloraminą T

   Do probówki przenieść 4,00 ml rozcieńczonego roztworu, dodać 2,00 ml odczynnika chloraminy T, wymieszać i pozostawić 20 ± 1 min w temperaturze pokojowej.

   ⏱ Czas: 20 min

7. Reakcja barwna

   Dodać 2,00 ml odczynnika barwnego, dokładnie wymieszać, zamknąć probówkę folią aluminiową lub plastikową i natychmiast wstawić do łaźni wodnej 60 °C na dokładnie 20 min.

   ⏱ Czas: 20 min • 🌡 Temperatura: 60 °C

8. Studzenie i pomiar

   Ochłodzić probówkę pod bieżącą wodą co najmniej 3 min, odstawić na 30 min w temperaturze pokojowej i zmierzyć absorbancję przy 558 ± 2 nm w kuwecie szklanej 10 mm wobec wody. Odjąć absorbancję ślepej próby (podwójnej, z wodą zamiast hydrolizatu).

   ⏱ Czas: 30 min

9. Krzywa wzorcowa

   Przeprowadzić czynności 6–8 z 4,00 ml każdego z czterech roztworów wzorcowych; wykreślić absorbancję (po odjęciu ślepej) względem stężenia i poprowadzić najlepiej dopasowaną prostą przez punkty i początek układu. Nową krzywą sporządzać dla każdej serii analiz.

10. Obliczenie

    wh = 6,25·c/(m·V), gdzie c — stężenie hydroksyproliny w rozcieńczonym hydrolizacie (µg/ml), m — masa odważki (g), V — objętość porcji hydrolizatu (ml). Podać wynik do 0,01 %; odrzucić oba wyniki i powtórzyć oznaczenie, gdy różnica przekracza r = 0,0131 + 0,0322·wh.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Kwas siarkowy 3 mol/l i stężony (przygotowanie roztworu) — okulary, rękawice, fartuch; kwas dodawać do wody, gorący hydrolizat sączyć ostrożnie
• Kwas nadchlorowy 60 % w odczynniku barwnym jest silnym utleniaczem — nie dopuszczać do kontaktu z materiałami organicznymi poza procedurą, pracować pod wyciągiem
• p-Dimetyloaminobenzaldehyd i chloramina T — unikać wdychania pyłu i kontaktu ze skórą
• Suszarka 105 °C przez 16 h — kolby przykryte szkiełkami zegarkowymi, wyjmować w rękawicach termicznych

Najczęstsze pytania