🦠 Gronkowce koagulazo-dodatnie w żywności — wykrywanie i NPL małych liczb (bulion Giolittiego i Cantoniego)

Mikrobiologia PN-EN ISO 6888-3

Przegląd

ISO 6888-3:2003 określa horyzontalną metodę oznaczania liczby i wykrywania gronkowców koagulazo-dodatnich techniką najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) w produktach dla ludzi i zwierząt oraz próbkach środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością. Zaleca się ją dla produktów, w których gronkowce są prawdopodobnie uszkodzone (stresowane) i nieliczne, np. w produktach suszonych. Gronkowce koagulazo-dodatnie to głównie Staphylococcus aureus, ale koagulazę wytwarzają też S. intermedius i niektóre szczepy S. hyicus. Definiuje się je jako bakterie tworzące typowe i/lub nietypowe kolonie na powierzchni selektywnego podłoża, wykazujące dodatnią reakcję koagulazy albo swoistą reakcję z plazmą króliczą na agarze RPF; potwierdzenie opiera się na wyraźnie dodatniej reakcji koagulazy, a szczepy słabo dodatnie odróżnia się dodatkowymi testami (np. termonukleaza, IDF 83). W skryptach UWM metoda ta figuruje jako „oznaczanie obecności lub NPL” gronkowców: posiew do pożywki Giolitti-Cantoni w 3 powtórzeniach (podwójnie stężonej przy 10 cm³ materiału), 37 °C/24–48 h beztlenowo, zaczernienie = wynik dodatni, potwierdzenie na RPF lub Baird-Parkerze. Norma została opublikowana z korektą (podpunkt 9.1.1); w Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 6888-3:2004.

Zasada metody

Wykrywanie: selektywne podłoże płynne inokuluje się określoną ilością próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej i inkubuje beztlenowo w 37 °C 24 h i 48 h — obecność domniemanych gronkowców koagulazo-dodatnich wskazuje redukcja tellurynu potasu (beztlenowość uzyskuje się korkiem z agaru lub parafiny w każdej probówce albo inkubacją w słoju/cieplarce beztlenowej). Z probówek dodatnich po 24 h, a z pozostałych po 48 h, posiewa się na powierzchnię agaru Baird-Parkera i inkubuje w 37 °C 24 h i 48 h — domniemane gronkowce wskazuje redukcja tellurynu i reakcja z żółtkiem jaja; kolonie typowe i nietypowe potwierdza się reakcją koagulazy. Alternatywnie posiewa się na agar z plazmą króliczą i fibrynogenem, gdzie kolonie ze swoistą reakcją są potwierdzeniem. Wynik: „obecne/nieobecne” w x g lub x ml. Oznaczanie: seryjne rozcieńczenia produktu inokuluje się do płynnego podłoża selektywnego, postępuje jak wyżej, a NPL na g lub ml odczytuje z tablic dla rozcieńczeń potwierdzonych. Zmodyfikowany bulion Giolittiego i Cantoniego (podłoże podstawowe, na 1000 ml; pojedynczo / podwójnie stężony): hydrolizat kazeiny 10/20 g, ekstrakt mięsny 5/10 g, ekstrakt drożdżowy 5/10 g, chlorek litu 5/10 g, mannitol 20/40 g, NaCl 5/10 g, glicyna 1,2/2,4 g, pirogronian sodu 3/6 g, Tween 80 1/2 g; do podłoża dodaje się roztwór tellurynu potasu (dalsza część rozdz. 5). Rozcieńczalniki wg ISO 6887, ISO 8261 lub normy dla produktu.

Zastosowania

• Produkty suszone i o niskiej aktywności wody (mleko w proszku, przyprawy, koncentraty), w których gronkowce są uszkodzone i nieliczne
• Wykrywanie obecności gronkowców koagulazo-dodatnich w określonej ilości produktu (np. 1 g, 10 g)
• Oznaczanie małych liczb poniżej granicy metod płytkowych ISO 6888-1/-2
• Próbki środowiskowe z produkcji i obrotu żywnością
• Pasze

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 6888-3:2004 (ISO 6888-3:2003)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków) — Część 3: Wykrywanie obecności i oznaczanie małych liczb metodą NPL

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 3: Detection and MPN technique for low numbers

Procedura krok po kroku

1. Próbka

   Przygotuj zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia wg ISO 6887 (odpowiednia część), ISO 8261 lub normy dla produktu.

2. Inokulacja bulionu

   Wykrywanie: określoną ilość próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej do probówki bulionu selektywnego (przy 10 ml materiału — podwójnie stężonego). Oznaczanie: seryjne rozcieńczenia do probówek bulionu (w praktyce po 3 probówki na rozcieńczenie).

3. Inkubacja beztlenowa

   Zapewnij beztlenowość (korek z agaru lub parafiny albo słój/cieplarka beztlenowa) i inkubuj w 37 °C; oceń po 24 h i 48 h — zaczernienie (redukcja tellurynu) oznacza probówkę domniemanie dodatnią.

4. Posiew na podłoże stałe

   Z probówek dodatnich po 24 h i z wszystkich pozostałych po 48 h posiej powierzchniowo na agar Baird-Parkera (37 °C, 24 h i 48 h) — kolonie z redukcją tellurynu i reakcją z żółtkiem są domniemane; alternatywnie na RPFA, gdzie swoista reakcja z plazmą jest potwierdzeniem.

5. Potwierdzenie

   Kolonie typowe i nietypowe z Baird-Parkera potwierdź reakcją koagulazy (wg UWM: 0,1 cm³ hodowli bulionowej + 0,3 cm³ plazmy króliczej, 37 °C, odczyt po 4–6 h, przy ujemnym — po dalszych 24 h); przy słabej reakcji — test termonukleazy.

6. Wynik

   Wykrywanie: obecne/nieobecne w x g lub ml. Oznaczanie: z liczby potwierdzonych probówek w poszczególnych rozcieńczeniach odczytaj NPL na g lub ml z tablic.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Gronkowce koagulazo-dodatnie wytwarzają enterotoksyny — praca w odpowiednio wyposażonym laboratorium pod nadzorem mikrobiologa, staranna utylizacja materiałów
• Telluryn potasu jest toksyczny — rękawice, unikanie pylenia; chlorek litu — unikać kontaktu
• Słoje beztlenowe z generatorami gazów — według instrukcji producenta; parafina — gorąca przy nakładaniu korków

Najczęstsze pytania