🦠 Gronkowce koagulazo-dodatnie w żywności — metoda płytkowa na agarze z plazmą króliczą i fibrynogenem (RPFA)

Mikrobiologia PN-EN ISO 6888-2

Przegląd

ISO 6888-1, ISO 6888-2 i ISO 6888-3 opisują trzy horyzontalne metody wykrywania i oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich, wśród których występują szczepy enterotoksynotwórcze — przede wszystkim Staphylococcus aureus, ale też S. intermedius i niektóre szczepy S. hyicus. Charakterystyka opiera się na dodatniej reakcji koagulazy; szczepy o słabo dodatniej reakcji można pomylić z innymi bakteriami i odróżnić dodatkowymi testami (wrażliwość na lizostafinę, hemolizyna, termostabilna nukleaza, kwas z mannitolu). ISO 6888-2:2021 (drugie wydanie, zastępujące ISO 6888-2:1999 z Amd 1:2003) określa metodę liczenia kolonii na agarze z plazmą króliczą i fibrynogenem po inkubacji tlenowej w 34–38 °C; stosuje się do produktów dla ludzi i zwierząt, próbek środowiskowych z produkcji żywności i pasz oraz próbek z produkcji pierwotnej. Zmiany wobec poprzedniego wydania to m.in. zalewanie podłożem w 44–47 °C (zgodnie z ISO 7218), zakres temperatur 34–38 °C zamiast „35 °C lub 37 °C”, czas 24 h ± 2 h zamiast 18–24 h, wymóg stosowania ISO 11133 i badania wykonania podłoża RPFA; zmiany uznano za drobne. Metody nie uważa się za w pełni przydatną do produktów fermentowanych z florą technologiczną Staphylococcus spp. (np. S. xylosus — sery z mleka surowego, niektóre surowe wyroby mięsne), zanieczyszczonych gronkowcami tworzącymi nietypowe kolonie na Baird-Parkerze lub florą maskującą kolonie; ISO 6888-1 i ISO 6888-2 mają równoważny status. Rozporządzenie (WE) 2073/2005 wskazuje EN/ISO 6888-2 jako metodę referencyjną kryterium higieny procesu dla serów z mleka surowego (10⁴–10⁵ jtk/g) oraz „EN/ISO 6888-1 lub 2” dla serów z mleka pasteryzowanego, serów świeżych, mleka i serwatki w proszku, produktów z mięczaków i skorupiaków (przy > 10⁵ jtk/g badanie na enterotoksyny).

Zasada metody

Przygotowuje się płytki metodą wgłębną z określoną ilością próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej i z rozcieńczeń dziesiętnych (liczba płytek wg ISO 7218); objętość podłoża RPFA dodana do inokulum jest punktem krytycznym dla reakcji koagulazy — do każdej płytki wlewa się natychmiast 18–20 ml świeżo przygotowanego kompletnego podłoża (B.2.3), aby uzyskać warstwę co najmniej 3 mm. Płytki inkubuje się tlenowo w 34–38 °C (cieplarki nastawione na 35 °C ± 1 °C, 36 °C ± 2 °C lub 37 °C ± 1 °C) i ocenia po 24 h ± 2 h, zaznaczając na dnie położenie kolonii typowych; gdy ich brak — reinkubacja do łącznie 48 h ± 4 h. Kolonie typowe są czarne, szare lub nawet białe, małe, otoczone mętną strefą precypitacji wskazującą na aktywność koagulazy; kolonie Proteus mogą początkowo wyglądać podobnie, lecz po 24–48 h brązowieją i rozpełzają się. Ponieważ podłoże opiera się na reakcji koagulazy, potwierdzanie nie jest potrzebne; mimo inhibitora trypsyny w RPFA kolonie typowe po 24 h mogą tracić typowy wygląd po 48 h (trypsyna, przerost), więc liczenie tylko po 48 h może dać zaniżone wyniki. Do liczenia zatrzymuje się płytki z maksymalnie 300 koloniami, w tym 100 typowymi; jedna płytka musi mieć co najmniej 10 kolonii; przy liczbach bliskich granicy oznaczania zaleca się duplikaty (suma ≥ 10 kolonii, co odpowiada > 5 jtk/ml lub > 50 jtk/g). Wynik oblicza się wg ISO 7218 jako jtk/g, jtk/ml, jtk/cm² lub na urządzenie do pobierania; skład podłoży i badania wykonania — załącznik B / ISO 11133; precyzja z badania międzylaboratoryjnego (sery, mięso, jaja w proszku, materiały odniesienia) — załącznik C. Zgodnie ze skryptem UWM zmętnienie wokół kolonii powstaje w wyniku reakcji koagulazy z protrombiną plazmy — powstała stafylotrombina tworzy z fibrynogenem polimery wytrącające się wokół kolonii.

Zastosowania

• Kryterium higieny procesu dla serów z mleka surowego (metoda referencyjna EN/ISO 6888-2) i innych serów, mleka i serwatki w proszku, produktów ze skorupiaków i mięczaków (6888-1 lub 2) — rozp. (WE) 2073/2005
• Wyroby mięsne, garmażeryjne, ciasta z kremem, lody — ocena higieny produkcji i ryzyka enterotoksyn gronkowcowych
• Próbki środowiskowe z produkcji żywności i pasz oraz z produkcji pierwotnej
• Alternatywa dla agaru Baird-Parkera (ISO 6888-1) bez etapu potwierdzania koagulazy w probówce
• Pasze i surowce

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 6888-2:2022-03 (ISO 6888-2:2021)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków) — Część 2: Metoda z zastosowaniem pożywki agarowej z plazmą króliczą i fibrynogenem

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 2: Method using rabbit plasma fibrinogen agar medium

Procedura krok po kroku

1. Próbka

   Przygotuj próbkę, zawiesinę wyjściową (10⁻¹) i rozcieńczenia wg serii ISO 6887 (powierzchnie — ISO 18593; pobieranie: ISO/TS 17728 żywność, ISO 707 mleko, ISO 17604 tusze, ISO 13307 produkcja pierwotna).

2. Posiew wgłębny

   Przenieś jałową pipetą 1 ml próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej (i kolejnych rozcieńczeń) do płytek Petriego w liczbie wg ISO 7218.

3. Zalanie RPFA

   Natychmiast wlej do każdej płytki 18–20 ml świeżo przygotowanego kompletnego podłoża RPFA (44–47 °C), aby uzyskać warstwę ≥ 3 mm; ostrożnie wymieszaj i pozostaw do zestalenia na poziomej powierzchni.

4. Inkubacja

   Odwrócone płytki inkubuj w 34–38 °C 24 h ± 2 h; zaznacz na dnie kolonie typowe. Jeśli brak kolonii lub kolonii typowych — reinkubuj dalsze 24 h ± 2 h (łącznie 48 h ± 4 h) i zaznacz nowe kolonie typowe.

5. Liczenie

   Policz kolonie typowe (czarne, szare lub białe, małe, z mętną strefą precypitacji); odróżnij Proteus (brązowienie, rozpełzanie). Zatrzymaj płytki z ≤ 300 kolonii, w tym ≤ 100 typowych, przy czym jedna płytka ≥ 10 kolonii; przy niskich liczbach użyj duplikatów (suma ≥ 10).

6. Wynik

   Oblicz wg ISO 7218 liczbę gronkowców koagulazo-dodatnich w jtk/g, ml, cm² lub na urządzenie do pobierania; bez kolonii — wynik wg ISO 7218 dla przypadków szczególnych; porównaj z kryteriami 2073/2005.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Gronkowce koagulazo-dodatnie mogą wytwarzać enterotoksyny — badania w odpowiednio wyposażonym laboratorium pod nadzorem mikrobiologa, staranna utylizacja materiałów po inkubacji
• Plazma królicza i fibrynogen — materiały pochodzenia zwierzęcego, sterylizowane filtracyjnie, przechowywane w lodówce
• Gorący agar 44–47 °C — ochrona przed poparzeniem

Najczęstsze pytania