🦠 Gronkowce koagulazo-dodatnie (S. aureus)
Oznaczanie liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus) w żywności metodą posiewu powierzchniowego na agarze Baird-Parkera z emulsją żółtka jaja i tellurkiem potasu.
Przegląd
Staphylococcus aureus jest jednym z najczęstszych czynników bakteryjnych zatruć pokarmowych na świecie. Gronkowce koagulazo-dodatnie wytwarzają termostabilne enterotoksyny (SE A–E), które nie ulegają zniszczeniu nawet podczas obróbki termicznej żywności. Wystarczy ok. 100 ng enterotoksyny, aby wywołać objawy zatrucia u człowieka. Źródłem kontaminacji żywności jest najczęściej personel produkcyjny (nosicielstwo nosowe, zakażone rany na dłoniach).
Norma PN-EN ISO 6888-1 opisuje horyzontalną metodę oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich z zastosowaniem selektywnego podłoża Baird-Parkera. Podłoże zawiera tellurek potasu i chlorek litu jako czynniki hamujące wzrost bakterii towarzyszących, natomiast glicyna i pirogronian sodu stymulują wzrost gronkowców. Kolonie S. aureus na tym podłożu są czarne lub szare, lśniące i wypukłe, otoczone strefą przejaśnienia (redukcja tellurku do telluru metalicznego).
Metoda jest stosowana globalnie jako złoty standard w oznaczaniu gronkowców w żywności. Pozwala na jednoczesne oznaczanie liczebności i wstępną identyfikację na podstawie morfologii kolonii. Potwierdzenie wykonuje się testem koagulazy w probówce lub metodą RPFA (Rabbit Plasma Fibrinogen Agar).
Badanie jest obligatoryjne w ramach Rozporządzenia (WE) nr 2073/2005 dla serów, mleka w proszku, produktów gotowych do spożycia oraz żywności dla niemowląt. Jest kluczowym elementem systemów HACCP w zakładach mleczarskich, cukierniczych i gastronomicznych.
Zasada metody
Metoda polega na posiewie powierzchniowym próbki na selektywne podłoże Baird-Parkera wzbogacone emulsją żółtka jaja z tellurkiem potasu. Tellurek potasu (K₂TeO₃) jest redukowany przez gronkowce do telluru metalicznego, co nadaje koloniom charakterystyczne czarne zabarwienie. Chlorek litu i tellurek hamują wzrost większości bakterii towarzyszących. Lecytynaza produkowana przez S. aureus powoduje opalizację (strefa przejaśnienia) wokół kolonii. Lipaza rozkłada tłuszcze żółtka, tworząc zewnętrzny pierścień precypitacji. Po inkubacji 24–48 h w 34–38°C, typowe kolonie potwierdza się testem koagulazy.
Zastosowania
- Kontrola jakości serów i produktów mleczarskich
- Badanie żywności gotowej do spożycia (RTE) — kryteria Rozporządzenia (WE) 2073/2005
- Monitoring higieny produkcji w cukierniach i zakładach gastronomicznych
- Kontrola żywności dla niemowląt i małych dzieci
- Badanie mięsa i przetworów mięsnych
- Badanie wymazów z rąk personelu i powierzchni roboczych (GHP)
- Analiza żywności w ramach postępowania epidemiologicznego (zatrucia pokarmowe)
- Weryfikacja skuteczności procesów termicznych i konserwujących
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Temperatura inkubacji | 34–38°C (optymalnie 37°C) |
| Czas inkubacji | 24 ± 2 h (odczyt wstępny) + 48 ± 4 h (odczyt końcowy) |
| Podłoże | Baird-Parker Agar + emulsja żółtka jaja z tellurkiem potasu |
| Typ kolonii | Czarne/szare, lśniące, wypukłe, otoczone strefą przejaśnienia |
| Metoda posiewu | Powierzchniowy (spread plate), 0,1–0,3 mL na płytkę |
| Potwierdzenie | Test koagulazy w probówce (osocze królicze) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 6888-1:2022
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i inne gatunki) — Część 1: Metoda z zastosowaniem podłoża agarowego Baird-Parkera
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 1: Method using Baird-Parker agar medium
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie próbki
Odważ 10 g (lub 25 g) próbki do woreczka stomachera. Dodaj 90 mL (lub 225 mL) wody peptonowej buforowanej. Homogenizuj 60–120 s.
2. Przygotowanie rozcieńczeń
Sporządź serię rozcieńczeń dziesiętnych (10⁻², 10⁻³). Użyj nowej pipety do każdego rozcieńczenia.
3. Przygotowanie podłoża
Rozpuść Baird-Parker Agar Base w wodzie destylowanej. Sterylizuj w 121°C przez 15 min. Schłodź do 47–50°C i dodaj aseptycznie emulsję żółtka z tellurkiem. Rozlej na płytki (ok. 18–20 mL). Wysusz płytki.
4. Posiew powierzchniowy
Nałóż po 0,1 mL (łącznie do 0,3 mL na 3 płytki z tego samego rozcieńczenia) na powierzchnię podłoża. Rozprowadź szpatułką Drigalskiego równomiernie po całej powierzchni.
5. Suszenie inokulum
Pozostaw płytki otwarte w komorze laminarnej do wchłonięcia inokulum (ok. 15 min).
6. Inkubacja
Odwróć płytki i inkubuj w 34–38°C. Odczytaj wstępnie po 24 ± 2 h, zaznacz typowe kolonie i kontynuuj inkubację do 48 ± 4 h.
7. Odczyt kolonii
Policz typowe kolonie (czarne/szare, lśniące, wypukłe, otoczone strefą przejaśnienia i/lub pierścieniem opalizacji). Zaznacz również kolonie atypowe (czarne bez stref).
8. Test koagulazy (potwierdzenie)
Wybierz min. 5 typowych i 5 atypowych kolonii. Zaszczep do 0,3 mL bulion BHI, inkubuj 24 h w 37°C. Dodaj 0,3 mL osocza króliczego. Inkubuj w 37°C i obserwuj tworzenie skrzepu po 4–6 h (max. 24 h).
9. Obliczenia
Oblicz liczbę gronkowców koagulazo-dodatnich z uwzględnieniem odsetka potwierdzonych kolonii. Wynik wyraź w jtk/g lub jtk/mL.
10. Kontrola jakości
Kontrola pozytywna: S. aureus ATCC 25923 (kolonie typowe). Kontrola negatywna: E. coli ATCC 25922 (brak wzrostu lub kolonie nietypowe). Kontrola jałowości podłoża.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator laboratoryjny 37°C | Binder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5 000–18 000 PLN |
| Komora laminarna klasy II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream AC2 | 25 000–60 000 PLN |
| Stomacher / homogenizator | Seward Stomacher 400 Circulator, Interscience BagMixer | 12 000–25 000 PLN |
| Łaźnia wodna 47–50°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12 | 3 000–10 000 PLN |
| Autoklaw laboratoryjny | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
| Szpatułki Drigalskiego (rozprowadzacz) | Szklane lub jednorazowe plastikowe, sterylne | 50–200 PLN / 100 szt. |
| Pipety automatyczne 0,1–1 mL | Eppendorf Research Plus, Gilson Pipetman | 400–1 200 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Baird-Parker Agar Base | 7790-58-1 | Podstawa podłoża selektywnego: tryptone, ekstrakt mięsny, ekstrakt drożdżowy, pirogronian sodu, glicyna, chlorek litu; op. 500 g |
| Emulsja żółtka jaja z tellurkiem potasu (EYT) | 7790-58-1 | Suplement do Baird-Parker Agar; 50 mL emulsji żółtka + 0,5% tellurek potasu; op. 100 mL |
| Pirogronian sodu | 113-24-6 | Czynnik wzrostu neutralizujący toksyczne nadtlenki, składnik podłoża |
| Chlorek litu | 7447-41-8 | Czynnik selektywny hamujący wzrost bakterii towarzyszących |
| Osocze królicze (Rabbit Plasma) | — | Do testu koagulazy w probówce (potwierdzenie), liofilizowane, op. 10 × 3 mL |
| Woda peptonowa buforowana (BPW) | — | Do przygotowania zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń, op. 500 g |
| Bulion BHI (Brain Heart Infusion) | — | Do namnażania izolatów przed testem koagulazy, op. 500 g |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- S. aureus — patogen BSL-2, stosować pełne środki ochrony osobistej
- Tellurek potasu — toksyczny, unikać wdychania i kontaktu ze skórą, pracować w komorze laminarnej
- Wszystkie czynności z otwartą próbką wykonywać w komorze laminarnej klasy II
- Zużyte materiały autoklawować przed utylizacją (121°C, 20 min)
- Dezynfekcja powierzchni 70% etanolem lub podchlorynem sodu 0,5%