🍎 Jakościowe wykrywanie organizmów genetycznie zmodyfikowanych (GMO) i produktów pochodnych w żywności (także w paszach i próbkach roślinnych) metodami opartymi na kwasach nukleinowych — DNA wyekstrahowane według ISO 21571 amplifikuje się w PCR (wykrywanie elektroforezą albo w real-time PCR, potwierdzanie hybrydyzacją, trawieniem restrykcyjnym lub sekwencjonowaniem) dla sekwencji swoistych dla taksonu, przesiewowych (np. promotor 35S), konstrukcji albo transformacji; z kontrolami i kryteriami z ISO 24276, optymalizacją startera (18–30 nukleotydów, ok. 60 °C), amplikonem 60–150 bp dla DNA silnie zdegradowanego; wynik „sekwencję docelową wykryto / nie wykryto” z granicą wykrywalności i materiałem odniesienia, PN-EN ISO 21569

Chemia żywności PN-EN ISO 21569

Przegląd

CO TA NORMA OPISUJE. Tekst normy czytamy w próbce iTeh dokumentu ISO 21569:2005 w wersji francuskiej („Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques”, pierwsze wydanie z 15.06.2005, wersja francuska z 2006): spis treści, przedmowa, wprowadzenie, rozdziały 1–10 i początek załącznika A do A.1.5.3 (metoda swoista dla soi) — próbka kończy się na stronie 9. Przedmowę europejską czytamy w próbce SIST EN ISO 21569:2005 (tekst angielski, do 7.6). Dalszej części załącznika A ani załączników B (metody przesiewowe), C (metody swoiste dla konstrukcji) i D (metody swoiste dla transformacji) nie czytamy; tytuły znamy ze spisu treści. Zmianę ISO 21569:2005/Amd 1:2013 czytamy w osobnej próbce iTeh (tekst francuski, „Amendement 1”, 2013-04-01): od okładki do A.6.3.3 (strona 11); dalszej części nowego punktu A.6 nie czytamy.

WEDŁUG TEKSTU ISO 21569:2005. Normę przygotował CEN/TC 275 „Analiza żywności — Metody horyzontalne” we współpracy z ISO/TC 34 (porozumienie wiedeńskie); według przedmowy EN normy krajowe miały ją wprowadzić najpóźniej w grudniu 2005. Wprowadzenie: badanie składników pochodzenia GM składa się z pobrania próbek (ISO 21568), ekstrakcji kwasów nukleinowych (ISO 21571), ich ewentualnego oczyszczenia, oznaczenia ilości, rozcieńczenia i analizy (np. PCR); metody ilościowe — ISO 21570, wymagania ogólne i definicje — ISO 24276; wykrywanie jakościowe stwierdza obecność albo nieobecność sekwencji docelowej z odpowiednimi kontrolami, w granicach wykrywalności metody i analizowanej porcji; metody z załączników A–D obejmują od przesiewowych po swoiste dla konstrukcji i transformacji; zgodność z normą może wymagać licencji na technologię PCR. Zakres (1): jakościowe wykrywanie GMO i produktów pochodnych w kwasach nukleinowych wyekstrahowanych z próbki, głównie metodami amplifikacji PCR; wymagania dla swoistego wykrywania i identyfikacji sekwencji docelowych i potwierdzania tożsamości produktu; opracowana dla matryc spożywczych, może być stosowana do innych (np. pasz i próbek roślinnych ze środowiska). Powołania (2): ISO 21571:2005 (ekstrakcja), ISO 24276 (wymagania ogólne i definicje, w chwili wydania w przygotowaniu). Zasada (4): każda metoda musi określać sekwencję docelową; wynik jakościowy musi jasno wskazywać obecność albo nieobecność elementu genetycznego, w granicach wykrywalności i porcji; amplifikacja polimerazą DNA ze starterami w cyklach denaturacja–przyłączanie–wydłużanie, po sprawdzeniu braku inhibitorów; wykrywanie elektroforezą żelową albo inną techniką, potwierdzenie tożsamości np. enzymami restrykcyjnymi, hybrydyzacją albo sekwencjonowaniem; w real-time PCR amplifikacja i wykrywanie są jednoczesne. Odczynniki (5): roztwory zwykle w ok. −20 °C, porcjowane, by uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania i kontaminacji; dNTP (dATP, dCTP, dGTP i dTTP albo dUTP — dUTP może wpływać na analizę enzymami restrykcyjnymi); bufor PCR, stężenie MgCl2 swoiste dla metody (w załącznikach); termostabilna polimeraza; startery. Postępowanie (7): DNA dostatecznie czyste, z powtarzalną i odtwarzalną jakością i ilością dla danej metody i matrycy; granica wykrywalności zależy od przetworzenia produktu i degradacji DNA; kontrole inhibicji zawsze według ISO 24276; warunki (MgCl2, profil termiczny) optymalizuje się dla każdej pary starterów; w optymalnej reakcji mniej niż 40 cykli wystarcza do zamplifikowania 10 cząsteczek docelowych, a zoptymalizowana PCR ma w 40 cyklach dać wykrywalny produkt ze 100 kopii DNA wzorcowego; zaleca się PCR z gorącym startem; wartości z walidacji mogą nie dotyczyć innych matryc i stężeń; długość produktu dopasowana do DNA w ekstrakcie — dla DNA silnie zdegradowanego z żywności przetworzonej 60–150 bp, dla surowców do ok. 250 bp; startery 18–30 nukleotydów, optymalna temperatura przyłączania ok. 60 °C, ustalana doświadczalnie (szacowana temperatura topnienia — 65 °C ze znakiem relacji nieczytelnym w tekście próbki), GC:AT możliwie 50:50, minimalna komplementarność końców 3′ i struktura drugorzędowa; walidacja teoretyczna (przeszukanie baz sekwencji, np. EMBL, GenBank) i doświadczalna swoistości; cele: sekwencje swoiste dla taksonu, konstrukcji, transformacji i elementy przesiewowe; kontrole obowiązkowe (ISO 24276), w miarę możliwości certyfikowane materiały odniesienia jako kontrola dodatnia i ujemna; potwierdzenie wyniku starterami dla innej sekwencji (zwłaszcza po badaniu przesiewowym) albo hybrydyzacją, trawieniem lub sekwencjonowaniem; przy sekwencjach z organizmów naturalnych (wirus, bakteria) trzeba sprawdzić, czy DNA pochodzi z GMO — np. promotor 35S pochodzi z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), więc jego wykrycie może oznaczać GMO albo sam CaMV. Interpretacja (8): wynik dodatni — swoisty produkt wykryty, a kontrole zgodne z tablicą 2 ISO 24276; ujemny — produktu nie wykryto przy zgodnych kontrolach; sekwencje swoiste dla transformacji mogą występować razem w jednym GMO (geny składane); wynik niejednoznaczny — powtórzenie. Wyrażanie wyników (9): bez „±”; wynik ujemny nigdy jako „brak GMO”; granica wykrywalności odniesiona co najmniej do jednego materiału odniesienia i wartości względnej w danej matrycy (np. 100 ng DNA GTS 40-3-2 przy 0,01 %); wynik ujemny: „Dla próbki X sekwencji docelowej Y nie wykryto. LOD metody wynosi x %, wyznaczona na ABC”, a gdy nie da się wykazać, że ilość DNA docelowego wystarcza do osiągnięcia LOD — dopisek, że ilość DNA gatunku mogła nie wystarczyć; wynik dodatni: „Dla próbki X sekwencję docelową Y wykryto”, z ewentualną tożsamością GMO; wyniki dwóch porcji muszą być spójne — przy rozbieżności powtórzenie, w miarę możliwości z większą ilością DNA, z kontrolą inhibicji. Sprawozdanie (10): według ISO 24276, co najmniej LOD z matrycą, opis swoistości i wyniki według rozdziału 9. Załącznik A.1 (soja, gen lektyny Le1, amplikon 118 bp, elektroforeza w żelu agarozowym): metoda walidowana w badaniach międzylaboratoryjnych BgVV z 1997 r. (25 laboratoriów, 220 zaakceptowanych wyników, 0 fałszywie dodatnich i ujemnych) i 1998/1999 (27 laboratoriów, 60 wyników, po 1 fałszywie dodatnim i ujemnym — 2 %), z ekstrakcją CTAB według ISO 21571:2005, A.3 (porcja 100 mg); bez amplifikacji DNA innych roślin uprawnych, wołowiny i wieprzowiny; LOD bezwzględnej nie wyznaczono, wykrywa co najmniej 0,1 ng DNA soi.

WEDŁUG ZMIANY ISO 21569:2005/AMD 1:2013. Zmianę przygotował ISO/TC 34 „Produkty spożywcze”, podkomitet SC 16 „Metody horyzontalne analizy molekularnej biomarkerów”. Wprowadzenie: z listy etapów usunięto pobieranie próbek (ISO 21568). Powołanie ISO 24276 dostaje datę 2006 (także w 8.1). 4.1, akapit 1 — nowe brzmienie: wynik jakościowy musi jasno wskazywać obecność albo nieobecność badanego elementu genetycznego, sprawdzaną z odpowiednimi kontrolami; uwaga: granica wykrywalności i wielkość porcji są krytycznymi cechami metody. 7.3.3.3.3: startery dla sekwencji swoistych dla taksonu mają niezawodnie wykrywać te sekwencje w „odpowiedniej” (zamiast „reprezentatywnej”) liczbie różnych przedstawicieli taksonu. 9.4 — nowe brzmienie: wyniki z tej samej porcji muszą być spójne — przy wynikach +/− w dwóch powtórzeniach powtarza się obie PCR, a jeśli nowe powtórzenia dadzą +/− albo −/−, porcję uznaje się za ujemną; wyniki wszystkich porcji muszą być spójne — gdy co najmniej jedna porcja daje wynik dodatni, a inna ujemny, analizę się powtarza; jeśli co najmniej jedno powtórzenie całego postępowania od ekstrakcji daje wynik niejednoznaczny, sprawozdanie powinno podać, że próbka jest ujemna na poziomie LOD. Rozdział 10: sprawozdanie podaje swoistość metody (swoista dla transformacji, dla konstrukcji albo przesiewowa). Załącznik A, nowy A.5 — metoda swoista dla ryżu (gen syntazy fosforanu sacharozy SPS, startery SPS F/SPS R, amplikon 279 bp, PCR konwencjonalna z elektroforezą): badanie międzylaboratoryjne GMDL-SJTU z 2007 r., 12 laboratoriów; 1 wynik fałszywie ujemny na 144 próbki ryżu (0,69 %) i 2 fałszywie dodatnie na 120 próbek innych roślin (1,67 %); LOD ok. 0,1 % ułamka masowego ryżu w mące kukurydzianej (przy 0,05 % i 0,01 % wyniki dodatnie tylko u części laboratoriów); ekstrakcja CTAB według ISO 21571:2005, A.3; mieszanina 30 µl, zalecane 100 ng DNA na reakcję; 35 cykli z przyłączaniem w 58 °C; żel agarozowy 20 g/l z bromkiem etydyny 0,5 µg/ml, 5 V/cm, 20 min; roztwory DNA w 4 °C najwyżej tydzień albo w −20 °C. Nowy A.6 — metoda swoista dla pomidora (gen LAT52), zoptymalizowana dla nasion, owoców, ketchupu, soku i innych przetworów: badanie międzylaboratoryjne 2007 r., 13 laboratoriów; 1 fałszywie ujemny na 156 (0,64 %) i 4 fałszywie dodatnie na 130 (3,08 %), które według tekstu mogą wynikać z kontaminacji przy PCR; LOD w badaniu wewnątrzlaboratoryjnym co najmniej 0,1 %.

STATUS (stan na 03.10.2026). W wyszukiwarce PKN (hasło „21569”, 03.10.2026) PN-EN ISO 21569:2007 (wersja polska, „Wprowadza: EN ISO 21569:2005 [IDT], ISO 21569:2005 [IDT]”) nie ma adnotacji o wycofaniu; obok element dodatkowy PN-EN ISO 21569:2007/A1:2013-07 (wersja angielska). Karta: data publikacji 16.01.2007, 71 stron, KT 287 Biotechnologii, ICS 67.050, „Zastępuje PN-EN ISO 21569:2005 – wersja angielska”, elementy dodatkowe PN-EN ISO 21569:2007/A1:2013-07E, bez adnotacji o wycofaniu. W katalogu iTeh (odczyt 03.10.2026) ISO 21569:2005 ma status „Published”, etap 90.92 (norma międzynarodowa do rewizji), od 29.08.2024; jako dokument rewidujący karta podaje ISO/TS 21569-10:2026, a wyszukiwarka iTeh pokazuje też projekt prEN ISO 21569-1.

ILE LABORATORIÓW I W JAKIEJ POSTACI (kopia bazy zakresów akredytacji, wsad do 17.09.2026, odczyt 03.10.2026). Numer 21569 stoi w 3 rekordach u 3 laboratoriów: AB 465, AB 685, AB 868. W aktualnych dokumentach PCA (odczyt 03.10.2026; AB 465 wyd. nr 31 z 23.12.2025, AB 685 wyd. nr 19 z 29.01.2026, AB 868 wyd. nr 21 z 06.03.2026) norma stoi w 3 wierszach u tych samych 3 laboratoriów — w wierszu AB 685 numer pada 8 razy (norma, zmiana A1:2013 i sześć instrukcji IN-01–IN-06 z wydaniem 03 z 29.12.2024); w każdym dokumencie liczba znaczników stron równa się liczbie stron PDF, bez powtórzeń; przeszukanie wszystkich dokumentów PCA pobranych z BIP 03.10.2026 nie dało laboratoriów spoza kopii bazy. Postać „PN-EN ISO 21569” bez roku z procedurą PBD-73.00.00 (AB 465), „PN-EN ISO 21569:2007” i „PN-EN ISO 21569:2007/A1:2013” z instrukcjami (AB 685), „PN-EN ISO 21569” razem z PN-EN ISO 21570 (AB 868). Żadna z tych pozycji nie jest zawieszona. Zakładka „Laboratoria” (hasło „PN-EN ISO 21569”) pokazuje wszystkie 3 laboratoria — sprawdzone zapytaniem zakładki na serwerze produkcyjnym labcoda.pl 03.10.2026.

CO BADAJĄ LABORATORIA (pozycje w PCA). AB 465: pasze (elastyczny zakres) — obecność modyfikacji genetycznych, real-time PCR / PCR; AB 685: pasze — obecność sekwencji swoistych dla GMO: ctp2–cp4 epsps, nptII, bar, pFMV, pat, P-35S, T-nos, real-time PCR; AB 868: produkty rolne i pasze dla zwierząt (elastyczny zakres) — obecność i zawartość modyfikacji genetycznych, PCR, real-time PCR, razem z PN-EN ISO 21570.

GDZIE ŁATWO O WYNIK POZORNIE POPRAWNY. Przy wyniku ujemnym: nie wolno pisać „brak GMO” — tylko „sekwencji docelowej Y nie wykryto” z LOD i materiałem odniesienia, a gdy DNA mogło nie wystarczyć, z dopiskiem (9.1, 9.2). Przy elemencie przesiewowym: promotor 35S i inne elementy z organizmów naturalnych (CaMV) mogą pochodzić z zakażenia, nie z GMO — trzeba wykluczyć obecność innego DNA tego organizmu (7.6); AB 685 bada P-35S. Przy DNA przetworzonym: degradacja obniża wykrywalność, a amplikon powinien mieć 60–150 bp (7.1, 7.3.2). Przy kontrolach: bez kontroli inhibicji i wyników kontroli zgodnych z ISO 24276 wynik nie jest ani dodatni, ani ujemny (7.1, 8.1); dwie porcje muszą dać zgodny wynik (9.4). Przy matrycy: norma powstała dla żywności, a pasze wymienia jako możliwe zastosowanie (1) — wszystkie trzy laboratoria badają pasze. Przy wynikach rozbieżnych: według zmiany A1:2013 porcja z wynikami +/− po powtórzeniu daje wynik ujemny, a niejednoznaczny wynik powtórzonego postępowania zapisuje się jako ujemny na poziomie LOD (9.4 w brzmieniu A1) — bez zmiany tekst wymagał zgodności dwóch porcji i powtórzenia. Przy wydaniu: AB 685 stosuje zmianę A1:2013, a AB 465 i AB 868 powołują normę bez roku.

CZEGO NIE PODAJEMY. Metod z załączników B–D (przesiewowych, swoistych dla konstrukcji i transformacji) i dalszej części metody dla soi nie przytaczamy — leżą poza próbką. Dalszej części punktu A.6 zmiany A1:2013 ani treści ISO 24276 nie czytaliśmy. Nie podajemy progów znakowania GMO z przepisów.

Zasada metody

DNA wyekstrahowane z próbki (ISO 21571) amplifikuje się w PCR z parą starterów swoistych dla sekwencji docelowej — swoistej dla taksonu, elementu przesiewowego, konstrukcji albo transformacji — w cyklach denaturacji, przyłączania starterów i wydłużania. Produkt wykrywa się elektroforezą żelową albo fluorescencyjnie w real-time PCR i potwierdza hybrydyzacją, trawieniem restrykcyjnym lub sekwencjonowaniem. Wynik — przy kontrolach zgodnych z ISO 24276 — brzmi „sekwencję docelową wykryto” albo „nie wykryto”, z granicą wykrywalności odniesioną do materiału odniesienia.

Zastosowania

• Jakościowe wykrywanie GMO i produktów pochodnych w żywności; możliwe zastosowanie do pasz i próbek roślinnych ze środowiska (1)
• Metody swoiste dla taksonu (np. lektyna soi), przesiewowe, swoiste dla konstrukcji i dla transformacji (załączniki A–D)
• Pasze i produkty rolne — pozycje w zakresach akredytacji 3 laboratoriów w PCA (PCR, real-time PCR)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 21569:2007

Tytuł (PL)

Artykuły żywnościowe — Metody wykrywania organizmów zmodyfikowanych genetycznie i produktów pochodnych — Metody jakościowe oparte na kwasach nukleinowych

Title (EN)

Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid based methods

Procedura krok po kroku

1. Ekstrakcja DNA

   Według ISO 21571; czystość, powtarzalność ilości, kontrola inhibicji (7.1). PN-EN ISO 21569:2007 bez adnotacji o wycofaniu w PKN (03.10.2026).

2. Dobór celu i starterów

   Takson, element przesiewowy, konstrukcja albo transformacja; amplikon dopasowany do degradacji DNA (7.3, 7.4).

3. PCR z kontrolami

   Optymalizacja MgCl2 i profilu termicznego, kontrole według ISO 24276, materiały odniesienia (7.2, 7.5).

4. Wykrywanie i potwierdzenie

   Elektroforeza albo real-time PCR; potwierdzenie hybrydyzacją, restrykcją lub sekwencjonowaniem; przy 35S wykluczenie CaMV (7.6).

5. Wynik

   Dodatni lub ujemny przy zgodnych kontrolach; zapis z LOD; dwie porcje zgodne (8, 9).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Praca z DNA i odczynnikami PCR — ochrona przed kontaminacją krzyżową (porcjowanie, oddzielne strefy)
• Elektroforeza — barwniki DNA i promieniowanie UV według kart charakterystyki

Najczęstsze pytania