🍎 Ilościowe oznaczanie organizmów genetycznie zmodyfikowanych (GMO) w żywności (także w paszach i próbkach roślinnych) metodami PCR — real-time PCR albo PCR kompetycyjną mierzy się sekwencję swoistą dla GMO i endogenną sekwencję swoistą dla taksonu, a wynik podaje jako ich stosunek w procentach; kalibracja odpowiednią liczbą punktów i powtórzeń (np. 4 × 2 albo 6 × 1) materiałami odniesienia (najlepiej certyfikowanymi) albo plazmidem lub syntetycznym dsDNA o równoważnym działaniu; DNA z każdej porcji co najmniej w dwóch powtórzeniach; kryteria spójności — odchylenia między rozcieńczeniami ± 33 %, między porcjami od −50 % do +100 % (ΔCt = 1); wynik „X ± niepewność %” albo jakościowo, gdy któraś sekwencja jest poniżej LOQ, PN-EN ISO 21570

Chemia żywności PN-EN ISO 21570

Przegląd

CO TA NORMA OPISUJE. Tekst normy czytamy w próbce iTeh dokumentu ISO 21570:2005 (tekst angielski, wydanie z 2005 r.): spis treści, przedmowa, wprowadzenie, rozdziały 1–10 i początek załącznika A do tablicy A.3 (metoda dla genu adh1 kukurydzy) — próbka kończy się na stronie 7. Dalszej części załącznika A ani załączników B (metoda przesiewowa 35S dla soi GTS 40-3-2), C (dziewięć metod swoistych dla konstrukcji: GTS 40-3-2, Event176, MON 810, Bt11, GA21, T25) i D (metody swoiste dla transformacji Bt11 i MON 810) nie czytamy; tytuły znamy ze spisu treści. Zmianę ISO 21570:2005/Amd 1:2013 czytamy w osobnej próbce iTeh (tekst rosyjski, „Изменение 1”, 2013-04-15): od okładki do A.2.10 (nowa metoda dla ryżu); dalszej części zmiany nie czytamy. Elementów AC:2007 i Ap1:2007 nie czytaliśmy.

WEDŁUG TEKSTU ISO 21570:2005. Normę przygotował CEN/TC 275 „Analiza żywności — Metody horyzontalne” we współpracy z ISO/TC 34 (porozumienie wiedeńskie). Wprowadzenie: badanie składników GM — pobranie, ekstrakcja (ISO 21571), oczyszczenie, oznaczenie ilości, rozcieńczenie, analiza (PCR); metody jakościowe — ISO 21569, wymagania ogólne — ISO 24276; zgodność może wymagać licencji na technologię PCR. Zakres (1): ogólne ramy ilościowych metod wykrywania GMO w żywności z użyciem PCR; wymagania dla swoistej amplifikacji sekwencji docelowych, by oznaczyć względną zawartość DNA pochodzącego z GMO i potwierdzić tożsamość; opracowana dla matryc spożywczych, ma też zastosowanie do innych, np. pasz i próbek roślinnych ze środowiska. Powołania (2): ISO 21569:2005, ISO 21571, ISO 24276 (w przygotowaniu), ISO Guide 32. Zasada (4): oznaczanie sekwencji docelowych, każda metoda określa sekwencje; PCR kompetycyjna albo real-time PCR; ilość elementu genetycznego wyraża się względem określonego odniesienia, kalibrantów i kontroli, w zakresie dynamicznym metody i porcji; analiza: amplifikacja, wykrywanie i potwierdzenie (w real-time PCR jednoczesne), oznaczenie względem kalibrantów; zwykle stosunek (w procentach) sekwencji GMO do endogennej sekwencji swoistej dla taksonu, czasem względem ilości matrycy (np. mikroorganizmy GM w żywności); kalibranty w miarę możliwości odniesione do certyfikowanych materiałów odniesienia. Odczynniki (5): identyczne lub równoważne podanym w metodzie, inaczej jakości do biologii molekularnej. Postępowanie (7): stężenie sekwencji w zakresie dynamicznym metody; uwaga — przebieg kontrolny dla taksonu pozwala ocenić, czy DNA ma wystarczającą jakość, czystość i ilość, zwłaszcza z matryc złożonych i silnie przetworzonych; DNA z każdej porcji analizuje się co najmniej w dwóch powtórzeniach; kontrole według ISO 24276, tablica 1; trzeba uwzględnić stabilność alleliczną i liczbę kopii sekwencji w odmianach różnego pochodzenia; kalibracja odpowiednią liczbą punktów i powtórzeń (np. cztery punkty po dwa powtórzenia albo sześć punktów po jednym), a jakość kalibracji wpływa na niepewność; zamiast genomowego materiału odniesienia można użyć rozcieńczeń plazmidu albo syntetycznego dsDNA, jeśli wykazano równoważne działanie; geny składane mogą prowadzić do zawyżenia zawartości GMO; LOQ według ISO 24276; obliczenie zawartości z liczby kopii na genom haploidalny zależy od homo- i heterozygotyczności; metoda ΔΔCt jest ważna tylko przy bardzo podobnej wydajności amplifikacji obu oznaczeń; minimum spójności, gdy wynik podaje się w procentach: w obrębie porcji — odrzucenie pomiarów poniżej LOQ i największe odchylenie między rozcieńczeniami i pomiarami równe oczekiwanemu z rozcieńczenia ± 33 %; między porcjami — wyniki nie mogą różnić się bardziej niż od −50 % do +100 % (ΔCt = 1 w real-time PCR; np. 1,0 % i 2,0 % — dopuszczalne, 0,9 % i 2,1 % — nie); dla dokładności trzeba wybrać i zbadać materiał odniesienia (najlepiej certyfikowany) dla danej transformacji, o podobnej matrycy; w jego braku — wewnętrzny materiał o wykazanej stabilności, jednorodności i spójności pomiarowej; niepewność ma spełniać wymagania dla kalibracji (ISO Guide 32). Interpretacja (8): wynik nadaje się do oznaczenia ilościowego, gdy jest dodatni według ISO 21569:2005, 8.1, inhibicja pomijalna, wartość jednoznaczna, zawartość w zakresie dynamicznym i kalibracja poprawna; inaczej — nie nadaje się; niepewność ma być dość mała do wyciągnięcia wniosków; gdy zawartość sekwencji GM albo swoistej dla taksonu jest poniżej LOQ, wynik podaje się tylko jakościowo (stwierdzenie „poniżej praktycznej LOQ” z jej wartością jest wynikiem jakościowym). Wyrażanie wyników (9, tablica 1): ilość sekwencji GM względem sekwencji swoistej dla taksonu, z niepewnością (np. odchylenie standardowe), LOD i LOQ metody oraz praktyczne LOD i LOQ; cztery przypadki — nie wykryto DNA gatunku; DNA gatunku wykryto, DNA GMO nie (z praktyczną LOD); oba wykryte, ale co najmniej jedna sekwencja poniżej LOQ — „wykryto DNA GMO” (z praktyczną LOQ); oba powyżej LOQ — „zawartość DNA GMO wynosi X ± niepewność %” (z jednostką); można też podać, że zawartość jest powyżej lub poniżej określonej wartości z uwzględnieniem niepewności. Sprawozdanie (10): według ISO 24276 i ISO 21569, dodatkowo LOQ metody z matrycą, praktyczna LOQ, metoda ekstrakcji DNA, materiał odniesienia, wyniki według rozdziału 9. Załącznik A.1 (gen adh1 kukurydzy, bezwzględne oznaczenie real-time PCR, regresja wartości Ct wobec znanych liczb kopii): startery ADH-FF3 i ADH-RR4 po 300 nmol/l, sonda ADH1-MDO (FAM/TAMRA) 200 nmol/l, amplikon 134 bp; MgCl2 25 mmol/l, dNTP po 2,5 mmol/l; objętość reakcji 25 µl, DNA wzorcowe do 250 ng w 5 µl, mieszanina gotowa 2X 12,5 µl.

WEDŁUG ZMIANY ISO 21570:2005/AMD 1:2013. Zmianę przygotował ISO/TC 34, podkomitet SC 16. Powołania ISO 21569, ISO 21571 i ISO 24276 zmieniono na wydania z 2005 i 2006 r. ze zmianami z 2013 r.; w 7.1 i w opisach metod w załącznikach „ISO 24276:—” zastąpiono „ISO 24276:2006”. Rozdziały 8–10 dostają nowe brzmienie. Interpretacja (8): wynik PCR nadaje się do oznaczenia ilościowego, gdy jest dodatni według 8.1 ISO 21569, inhibicja jest nieistotna, pomiar jest jednoznaczny, ilość sekwencji leży w zakresie dynamicznym i kalibracja jest właściwa (7.3) — inaczej się nie nadaje; przy wynikach +/− w dwóch powtórzeniach powtarza się dwie PCR, a jeśli znów +/− albo −/−, porcję uznaje się za ujemną; przy wynikach ± z dwóch porcji ekstrahuje się i bada dwie nowe, a przy ponownym +/− porcję uznaje się za ujemną (ISO 24276:2006, 6.3); niepewność ma być na tyle mała, by laboratorium mogło wydać uzasadniony wniosek; obliczenie ilości GMO z ilości DNA zwykle uwzględnia homo- i heterozygotyczność; gdy sekwencja GM albo swoista dla taksonu jest poniżej LOQ, wynik podaje się tylko jakościowo, a stwierdzenie „poniżej praktycznej LOQ” z jej wartością uznaje się za wyrażenie jakościowe. Wyrażanie wyników (9): ilość sekwencji GM względem sekwencji swoistej dla taksonu z niepewnością (np. odchylenie standardowe albo współczynnik zmienności), LOD i LOQ metody oraz praktyczne; wynik dotyczy tylko celów GMO; przy metodzie przesiewowej i matrycach złożonych zaleca się zaznaczyć, że sygnał może pochodzić z taksonów niebędących celem; zawartość można podać jako powyżej lub poniżej wartości z uwzględnieniem niepewności; tablica 1 podaje cztery formuły: brak DNA gatunku („Dla gatunku X DNA nie wykryto”), brak sekwencji GM (według ISO 21569, z LOD metody i materiałem odniesienia, a gdy nie da się wykazać wystarczającej ilości DNA — z dopiskiem i LOD próbki), sekwencja wykryta poniżej praktycznej LOQ, wynik ilościowy „x ± u %”. Sprawozdanie (10): według ISO 24276 i ISO 21569, co najmniej LOQ metody z materiałem, praktyczna LOQ, metoda ekstrakcji, metody amplifikacji, materiał odniesienia, wynik według 9, cel PCR i rodzaj metody (swoista dla transformacji, dla konstrukcji, przesiewowa), sposób wyznaczenia niepewności. Załącznik A, nowy A.2 — metoda swoista dla ryżu (gen syntazy fosforanu sacharozy SPS, fragment 81 pz, real-time PCR z sondą TaqMan): badanie międzylaboratoryjne GMDL-SJTU, 12 laboratoriów, osiem ślepych próbek DNA 0,5–10 ng; współczynnik zmienności powtarzalności 14,29–20,98 %, odtwarzalności 10,84–31,92 %, błąd systematyczny od −26,53 % do +8,92 %; w zakresie dynamicznym 0,05–1,00 ng błąd systematyczny w badaniu wewnątrzlaboratoryjnym poniżej 25 %; LOQ bezwzględna 0,01 ng/µl, względnej LOQ nie oceniano; swoistość: dodatni tylko ryż spośród 11 roślin, dodatnie wszystkie 12 odmian ryżu; ekstrakcja CTAB według ISO 21571; oddzielne strefy ekstrakcji, przygotowania PCR i amplifikacji, końcówki z filtrem, rękawice bezpudrowe. W tekście rosyjskim punkt A.2.4 opisuje sondę z barwnikiem FAM i oznaczanie „DNA adh1 ryżu”, a tablica A.6 podaje sondę SPS z barwnikiem HEX — tych rozbieżności nie rozstrzygamy, bo nie czytaliśmy tekstu angielskiego zmiany.

STATUS (stan na 03.10.2026). W wyszukiwarce PKN (hasło „21570”, 03.10.2026) PN-EN ISO 21570:2007 (wersja polska, „Wprowadza: EN ISO 21570:2005 [IDT], ISO 21570:2005 [IDT]”) nie ma adnotacji o wycofaniu; obok element dodatkowy PN-EN ISO 21570:2007/A1:2013-06 (wersja angielska). Karta: data publikacji 12.01.2007, 110 stron, KT 287 Biotechnologii, ICS 67.050, „Zastępuje PN-EN ISO 21570:2006 – wersja angielska”, elementy dodatkowe PN-EN ISO 21570:2007/AC:2007P, PN-EN ISO 21570:2007/Ap1:2007P i PN-EN ISO 21570:2007/A1:2013-06E, bez adnotacji o wycofaniu. W katalogu iTeh (odczyt 03.10.2026) ISO 21570:2005 ma status „Published”, etap 90.60 (zamknięcie przeglądu), ze zmianą Amendment 1.

ILE LABORATORIÓW I W JAKIEJ POSTACI (kopia bazy zakresów akredytacji, wsad do 17.09.2026, odczyt 03.10.2026). Numer 21570 stoi w 3 rekordach u 3 laboratoriów: AB 465, AB 704, AB 868. W aktualnych dokumentach PCA (odczyt 03.10.2026; AB 465 wyd. nr 31 z 23.12.2025, AB 868 wyd. nr 21 z 06.03.2026, AB 704 wyd. nr 23 z 20.04.2026) numer stoi w 3 wierszach u tych samych 3 laboratoriów; w każdym dokumencie liczba znaczników stron równa się liczbie stron PDF, bez powtórzeń; przeszukanie wszystkich dokumentów PCA pobranych z BIP 03.10.2026 nie dało laboratoriów spoza kopii bazy. Postać zawsze „PN-EN ISO 21570” bez roku — z procedurami PBD-74.00.00 i PBD-75.00.00 (AB 465), z „procedurami opracowanymi przez laboratorium” (AB 704) albo razem z PN-EN ISO 21569 (AB 868). Żadna z tych pozycji nie jest zawieszona. Zakładka „Laboratoria” (hasło „PN-EN ISO 21570”) pokazuje wszystkie 3 laboratoria — sprawdzone zapytaniem zakładki na serwerze produkcyjnym labcoda.pl 03.10.2026.

CO BADAJĄ LABORATORIA (pozycje w PCA). AB 465: pasze (elastyczny zakres) — zawartość modyfikacji genetycznych, real-time PCR; AB 704: produkty rolne, żywność (artykuły spożywcze) (elastyczny zakres) — obecność i zawartość GMO, real-time PCR; AB 868: produkty rolne i pasze dla zwierząt (elastyczny zakres) — obecność i zawartość modyfikacji genetycznych, PCR i real-time PCR.

GDZIE ŁATWO O WYNIK POZORNIE POPRAWNY. Przy jednostce: wynik to stosunek sekwencji GM do sekwencji swoistej dla taksonu (najczęściej w procentach), a nie udział masowy — jednostkę trzeba podać (4.3, tablica 1). Przy LOQ: gdy którakolwiek z dwóch sekwencji jest poniżej LOQ, liczby nie podaje się — tylko wynik jakościowy z praktyczną LOQ (8). Przy spójności: dwie porcje muszą się zgadzać w granicach −50 % do +100 % (1,0 i 2,0 % — tak, 0,9 i 2,1 % — nie), a pomiary w rozcieńczeniach — w granicach ± 33 % (7.5). Przy obliczeniach: ΔΔCt tylko przy bardzo podobnej wydajności obu reakcji; liczba kopii na genom haploidalny zależy od zygotyczności; geny składane zawyżają zawartość (7.4). Przy kalibracji: kalibranty odniesione do certyfikowanych materiałów odniesienia, a plazmid lub syntetyczne dsDNA tylko po wykazaniu równoważności (4.3, 7.3). Przy matrycy: DNA z matryc złożonych i silnie przetworzonych może nie nadawać się do oznaczenia — warto wykonać przebieg kontrolny dla taksonu (7.1). Przy wynikach rozbieżnych: według zmiany A1:2013 powtórzone wyniki +/− dają porcję ujemną (8 w brzmieniu A1). Przy sprawozdaniu: zmiana A1:2013 wymaga podania praktycznej LOQ, materiału odniesienia, rodzaju metody i sposobu wyznaczenia niepewności (10 w brzmieniu A1). Przy wydaniu: wszystkie laboratoria powołują normę bez roku, obok procedur własnych; karta PKN wymienia trzy elementy dodatkowe, a zmiana A1:2013 przebudowuje rozdziały 8–10.

CZEGO NIE PODAJEMY. Dalszej części metody dla adh1 ani metod z załączników B–D nie przytaczamy — leżą poza próbką. Treści AC:2007, Ap1:2007, dalszej części zmiany A1:2013 ani ISO 24276 nie czytaliśmy. Nie podajemy progów znakowania GMO z przepisów.

Zasada metody

W DNA wyekstrahowanym z próbki oznacza się metodą real-time PCR (albo PCR kompetycyjną) dwie sekwencje: swoistą dla GMO (elementu przesiewowego, konstrukcji albo transformacji) i endogenną, swoistą dla taksonu. Liczby kopii wyznacza się z krzywych kalibracji z materiałów odniesienia — najlepiej certyfikowanych — a zawartość GMO wyraża jako stosunek obu sekwencji w procentach, z niepewnością. Wynik liczbowy podaje się tylko, gdy obie sekwencje są powyżej LOQ, a pomiary w porcjach i rozcieńczeniach spełniają kryteria spójności.

Zastosowania

• Ilościowe oznaczanie GMO w żywności; także w paszach i próbkach roślinnych ze środowiska (1)
• Przykładowe metody real-time PCR dla kukurydzy (adh1, Event176, MON 810, Bt11, GA21, T25) i soi GTS 40-3-2 (załączniki A–D)
• Pasze, produkty rolne i żywność — pozycje w zakresach akredytacji 3 laboratoriów w PCA (real-time PCR)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 21570:2007

Tytuł (PL)

Artykuły żywnościowe — Metody wykrywania organizmów zmodyfikowanych genetycznie i produktów pochodnych — Metody ilościowe oparte na kwasach nukleinowych

Title (EN)

Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Quantitative nucleic acid based methods

Procedura krok po kroku

1. DNA

   Ekstrakcja według ISO 21571; przebieg kontrolny dla taksonu przy matrycach przetworzonych (7.1). PN-EN ISO 21570:2007 bez adnotacji o wycofaniu w PKN (03.10.2026).

2. Kalibracja

   Punkty i powtórzenia w zakresie oznaczania, kalibranty odniesione do CRM (7.3).

3. Pomiar

   Sekwencja GMO i swoista dla taksonu, każda porcja co najmniej w dwóch powtórzeniach, kontrole według ISO 24276 (7.1).

4. Spójność i interpretacja

   ± 33 % w rozcieńczeniach, −50 %…+100 % między porcjami; warunki przydatności do oznaczenia ilościowego (7.5, 8).

5. Wynik

   Według tablicy 1: X ± niepewność % albo wynik jakościowy z praktyczną LOD/LOQ; LOD i LOQ metody w sprawozdaniu (9, 10).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Praca z DNA i odczynnikami PCR — ochrona przed kontaminacją krzyżową
• Odczynniki według kart charakterystyki producenta

Najczęstsze pytania