🦠 Cryptosporidium i Giardia w wodzie — filtracja kapsułowa, separacja immunomagnetyczna i mikroskopia immunofluorescencyjna
Krótko: o co chodzi
Duża objętość wody (10–1000 l) jest zagęszczana na kapsule filtracyjnej, filtr wypłukuje się buforem elucyjnym i wiruje (1100 × g, 15 min); z osadu wydziela się oocysty i cysty metodą separacji immunomagnetycznej, barwi przeciwciałem monoklonalnym znakowanym FITC oraz barwnikiem jądrowym DAPI i liczy pod mikroskopem epifluorescencyjnym z kontrastem DIC przy powiększeniu 1000×. Badanie wykonuje się według normy ISO 15553:2006; Oznaczane formy: Oocysty Cryptosporidium i cysty Giardia (bez identyfikacji do gatunku i bez oceny żywotności). Procedura obejmuje 10 kroków (łącznie około 20–20 min); stosuje się je m.in. do: Kontrola wody przeznaczonej do spożycia z ujęć powierzchniowych i mieszanych (badanie poza obowiązkowym zakresem Dz. U. 2026 poz. 748), Ocena skuteczności uzdatniania — bariery dla form przetrwalnych opornych na chlor, Badanie wód powierzchniowych i podziemnych ujmowanych przez wodociągi.
W skrócie
- Norma: ISO 15553:2006
- Kategoria: Mikrobiologia
- Kroków procedury: 10
- Łączny czas etapów: 20 min–20 min
- Oznaczane formy: Oocysty Cryptosporidium i cysty Giardia (bez identyfikacji do gatunku i bez oceny żywotności)
- Objętość próbki: 10–1000 l; przy małych objętościach (10–100 l) próbka punktowa, przy 1000 l filtracja na miejscu poboru
- Czas do wykonania badania: Najlepiej w ciągu 24 h od pobrania, nie dłużej niż 4 doby; przechowywanie w (5 ± 3) °C
Przegląd
Cryptosporidium i Giardia to pierwotniaki pasożytnicze wywołujące u ludzi choroby jelitowe. Obie formy przetrwalne — oocysty i cysty — przeżywają długo w środowisku wodnym, a oocysty Cryptosporidium są oporne na chlor w stężeniach stosowanych w uzdatnianiu wody do picia i wody basenowej. Z tego powodu, jak stwierdza wprowadzenie do normy, brak wegetatywnych bakterii wskaźnikowych zanieczyszczenia kałowego nie jest dowodem nieobecności tych pierwotniaków — wynik badania E. coli czy enterokoków nic o nich nie mówi.
ISO 15553:2006 opisuje wykrywanie i oznaczanie liczby oocyst Cryptosporidium i cyst Giardia w wodach powierzchniowych i podziemnych, w wodzie uzdatnionej, w wodach mineralnych oraz w wodzie basenowej i rekreacyjnej. Metoda nie pozwala na identyfikację do gatunku, na ustalenie gospodarza, z którego pochodzą, ani na ocenę żywotności lub zakaźności znalezionych form; norma zastrzega też, że badanie mogą wykonywać wyłącznie doświadczeni analitycy po zdanych testach kompetencji, regularnie sprawdzani na próbkach fortyfikowanych i w badaniach biegłości. W preparacie mogą się pojawić obiekty morfologicznie podobne do oocyst i cyst — przy wątpliwościach lub nietypowo wysokim wyniku norma zaleca przekazanie preparatów do oceny ekspertom z innego laboratorium.
Norma nie została wprowadzona do zbioru Polskich Norm — w katalogu PKN nie ma jej krajowego przyjęcia, a polskie prace metodyczne (NIZP–PZH) powołują się wprost na ISO 15553:2006. Obowiązujące rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 22 maja 2026 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi (Dz. U. z 2026 r. poz. 748) nie wymienia Cryptosporidium ani Giardia wśród parametrów wody ani wśród parametrów mikrobiologicznych, dla których wskazano metody referencyjne; badanie wykonuje się więc poza obowiązkowym zakresem, na potrzeby oceny ryzyka i dochodzeń epidemiologicznych. Wcześniejszy stan prawny opisuje praca NIZP–PZH z 2012 r.: rozporządzenie obowiązujące w tamtym czasie wskazywało konieczność badania w kierunku Cryptosporidium sp. w wodzie z ujęć powierzchniowych lub mieszanych wtedy, gdy w wodzie uzdatnionej wykryto Clostridium perfringens, przy czym — jak zaznaczają autorzy — badań tych w rutynowej kontroli w Polsce nie prowadzono. Wydanie pierwsze z 2006 r. pozostaje aktualne: ISO potwierdziło je w przeglądzie systematycznym 22 marca 2021 r., a kolejny przegląd, rozpoczęty 15 stycznia 2026 r., został zamknięty 5 czerwca 2026 r. — w karcie cyklu życia nie zapisano jeszcze jego rozstrzygnięcia. Normy zastępującej nie wskazano. W badaniach NIZP–PZH prowadzonych wg założeń tej normy w wodzie z ujęć powierzchniowych (Wisła, Zalew Zegrzyński) cysty Giardia wykryto we wszystkich próbkach (1,0–38,9 na 10 l), a oocysty Cryptosporidium w blisko połowie próbek (0,5–2,5 na 10 l).
TYTUŁ POLSKI W TYM WPISIE TO NASZE TŁUMACZENIE ROBOCZE, nie tytuł urzędowy: norma nie została wprowadzona do zbioru Polskich Norm.
Zasada metody
Izolacja pierwotniaków z wody wymaga zmniejszenia objętości próbki przy zatrzymaniu oocyst i cyst. Norma opisuje dwie techniki zagęszczania — filtrację kapsułową z elucją, a następnie wirowanie z małą prędkością. Z zagęszczonej zawiesiny cząstek stałych oocysty i cysty wydziela się metodą separacji immunomagnetycznej (IMS): wiążą się one z paramagnetycznymi kulkami opłaszczonymi swoistym przeciwciałem, kulki oddziela się magnesem od niepotrzebnej materii, po czym oocysty i cysty odłącza się od kulek kwasem i zobojętnia zasadą. Wydzielone organizmy znakuje się przeciwciałem monoklonalnym sprzężonym z fluorochromem (zwykle izotiocyjanianem fluoresceiny, FITC), a materiał jądrowy — barwnikiem kwasów nukleinowych; preparat ogląda się w mikroskopie epifluorescencyjnym z kontrastem interferencyjno-różnicowym (DIC).
Zastosowania
- Kontrola wody przeznaczonej do spożycia z ujęć powierzchniowych i mieszanych (badanie poza obowiązkowym zakresem Dz. U. 2026 poz. 748)
- Ocena skuteczności uzdatniania — bariery dla form przetrwalnych opornych na chlor
- Badanie wód powierzchniowych i podziemnych ujmowanych przez wodociągi
- Woda basenowa i rekreacyjna (norma wymienia je wprost w zakresie)
- Wody mineralne i woda uzdatniona rozprowadzana w sieci
- Dochodzenia epidemiologiczne przy podejrzeniu ogniska choroby wodozależnej
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Oznaczane formy | Oocysty Cryptosporidium i cysty Giardia (bez identyfikacji do gatunku i bez oceny żywotności) |
| Objętość próbki | 10–1000 l; przy małych objętościach (10–100 l) próbka punktowa, przy 1000 l filtracja na miejscu poboru |
| Czas do wykonania badania | Najlepiej w ciągu 24 h od pobrania, nie dłużej niż 4 doby; przechowywanie w (5 ± 3) °C |
| Wirowanie eluatu | 1100 × g przez 15 min, bez hamowania w fazie wytracania obrotów |
| Mikroskopia | Powiększenie całkowite 1000×, filtr UV (wzb. 350 nm / em. 450 nm), filtr FITC (wzb. 480 nm / em. 520 nm), optyka DIC |
| Odzysk (dane NIZP–PZH, stacja Filta-Max xpress, 9 cykli płukania) | Średnio 60,6 % dla oocyst Cryptosporidium i 36,1 % dla cyst Giardia |
Norma
- Numer normy
- ISO 15553:2006
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Izolowanie i identyfikacja oocyst Cryptosporidium i cyst Giardia z wody
- Title (EN)
- Water quality — Isolation and identification of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water
Procedura krok po kroku
-
Pobranie próbki
Objętość dobrać do rodzaju wody i wymaganej czułości: 10–100 l jako próbka punktowa przewożona do laboratorium albo do 1000 l filtrowane na miejscu poboru. Przy dużych objętościach kapsułę podłączyć w linii zgodnie z kierunkiem przepływu wskazanym przez wytwórcę, z przepływomierzem odczytanym przed i po poborze; nie przekraczać zalecanych przepływów. Filtrowanie 1000 l może trwać do 24 h.
-
Transport i przechowywanie
Próbki punktowe i filtry przewozić w ciemności, w temperaturze otoczenia. W laboratorium przechowywać w (5 ± 3) °C, jeżeli badanie nie zaczyna się od razu. Filtr wychłodzony doprowadzić do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem elucji.
-
Elucja filtra
Kapsułę Envirochek STD ustawić pionowo zaworem odpowietrzającym do góry, zdjąć obie zaślepki i spuścić wodę pozostałą w próbce przez filtr. Założyć dolną zaślepkę, napełnić kapsułę buforem elucyjnym tak, by przykrył filtr na ok. 1 cm, zamknąć i wytrząsać poziomo przy 600 ± 25 cykli/min. Po pierwszym wytrząsaniu popłuczyny przelać do probówki stożkowej 250 ml, dodać kolejną porcję buforu i wytrząsać powtórnie, zmieniając położenie zaworu odpowietrzającego.
-
Wirowanie i pomiar objętości osadu
Połączone popłuczyny odwirować przy 1100 × g przez 15 min bez hamowania w fazie wytracania obrotów. Zaraz po wirowaniu odczytać objętość osadu. Jeżeli przekracza wartość zalecaną przez wytwórcę zestawu IMS, próbkę podzielić na podpróbki.
-
Odciągnięcie supernatantu i wyrównanie objętości
Supernatant odciągnąć pipetą przy podciśnieniu mniejszym niż 20 kPa, pozostawiając 2–5 ml nad osadem; przy niewidocznym osadzie zachować szczególną ostrożność. Uzupełnić wodą dejonizowaną do 9 ml i worteksować 10–15 s. Zawiesinę można przechować w (5 ± 3) °C do czasu IMS.
-
Separacja immunomagnetyczna (IMS)
Oocysty i cysty związać z paramagnetycznymi kulkami opłaszczonymi swoistym przeciwciałem, oddzielić kulki od pozostałej materii magnesem, a następnie odłączyć organizmy od kulek kwasem i zobojętnić zasadą przed barwieniem immunologicznym.
-
Barwienie preparatu
Wydzielone organizmy wyznakować przeciwciałem monoklonalnym sprzężonym z fluorochromem (zwykle FITC), a materiał jądrowy — barwnikiem kwasów nukleinowych (DAPI). Preparaty inkubować w komorze wilgotnej, zamknąć medium do immunofluorescencji.
-
Ocena mikroskopowa
Preparat przeglądać w mikroskopie epifluorescencyjnym przy powiększeniu całkowitym 1000×, z filtrem FITC (wzbudzenie 480 nm, emisja 520 nm) i filtrem UV (350/450 nm) oraz w kontraście DIC. Struktury podobne morfologicznie do oocyst i cyst mogą dawać wyniki fałszywie dodatnie — przy wątpliwości lub nietypowo wysokim wyniku preparat przekazać do oceny ekspertom z innego laboratorium.
-
Kontrola jakości i odzysk
Norma przewiduje osobne procedury kontroli jakości (rozdz. 8) oraz przygotowanie kontroli dodatnich i testy odzysku (załącznik D). W praktyce NIZP–PZH próbki wody wodociągowej o objętości 20 l fortyfikowano odważoną zawiesiną odniesienia (99 ± 1,4 oocysty i 99 ± 1,6 cysty) i z niej liczono odzysk.
-
Podanie wyniku
Wynik podaje się jako liczbę oocyst Cryptosporidium i cyst Giardia w przebadanej objętości wody (w polskich pracach zwykle na 10 l). W sprawozdaniu należy odnotować objętość przefiltrowanej wody i zastosowany system filtracyjny, bo od nich zależy czułość oznaczenia.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Kapsuła filtracyjna do zagęszczania próbki | Pall Envirochek STD (10–200 l), Pall Envirochek HV (10–1000 l) albo IDEXX Filta-Max (10–1000 l) — norma wymienia te trzy systemy w tablicy 1 | — |
| Pompa perystaltyczna | Wydajność 2 l/min (Envirochek) lub 4 l/min (Filta-Max), z wężem silikonowym | — |
| Wytrząsarka nadgarstkowa (wrist-action) | Z ramionami do mocowania kapsuł Envirochek, praca przy 600 ± 25 cykli/min | — |
| Wirówka laboratoryjna | Przyspieszenie co najmniej 1100 × g, probówki stożkowe 250 ml i 50 ml z zakrętką | — |
| Koncentratory cząstek magnetycznych do IMS | Statywy magnetyczne z probówkami dobranymi do zestawu IMS | — |
| Mikroskop epifluorescencyjny z optyką DIC | Filtr UV 350/450 nm, filtr FITC 480/520 nm, okular z siatką pomiarową, powiększenie 1000×; do kalibracji mikrometr przedmiotowy 1 mm | — |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Bufor elucyjny do kapsuł Envirochek | — | Sporządzany wg załącznika A z buforu Tris pH 7,4, roztworu EDTA 0,5 mol/l pH 8,0, detergentu Laureth 12 i środka przeciwpiennego Antifoam A |
| Bufor fosforanowy (PBS) z Tween 20 | — | Bufor elucyjny do filtrów Filta-Max — PBS z dodatkiem monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (Tween 20); przechowywanie w temperaturze pokojowej (20 ± 5) °C |
| Kulki magnetyczne do IMS | — | Paramagnetyczne kulki opłaszczone przeciwciałami przeciw Cryptosporidium i Giardia; data ważności podana przez wytwórcę |
| Przeciwciała monoklonalne znakowane fluorescencyjnie | — | Przeciw Cryptosporidium i Giardia, przechowywanie w (5 ± 3) °C; roztwór roboczy sporządzony z koncentratu — nie dłużej niż 6 miesięcy w (5 ± 3) °C |
| DAPI — dichlorowodorek dihydratu 4′,6′-diamidyno-2-fenyloindolu | — | Odczynnik liofilizowany, z którego sporządza się roztwór podstawowy i roboczy (A.3.2, A.3.3); barwi materiał jądrowy, obserwacja w świetle UV 350 nm |
| Zawiesiny wzorcowe oocyst C. parvum i cyst G. lamblia | — | Przechowywanie w (5 ± 3) °C, nigdy nie zamrażać; najlepiej nie starsze niż 3 miesiące, sprawdzane mikroskopowo (odrzucić przy zbrylaniu) |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Cryptosporidium i Giardia są chorobotwórcze dla człowieka (choroby jelitowe) — próbki, koncentraty i zawiesiny wzorcowe traktować jako materiał zakaźny
- Oocysty Cryptosporidium są oporne na chlor w stężeniach stosowanych do uzdatniania wody — dezynfekcja podchlorynem nie jest wiarygodnym sposobem odkażania sprzętu po pracy z tym materiałem
- Zawiesiny wzorcowe przechowywać w (5 ± 3) °C i nigdy nie zamrażać; nie używać zawiesin zbrylonych ani ze słabnącym wybarwieniem
- Badanie wykonują wyłącznie analitycy po zdanych testach kompetencji, regularnie sprawdzani na próbkach fortyfikowanych i w zewnętrznych programach badań biegłości
- Metanol i rozpuszczalniki stosowane do utrwalania preparatów — praca pod wyciągiem, z dala od źródeł zapłonu, w rękawicach i okularach ochronnych
Najczęstsze pytania
Jaka norma opisuje to badanie?
Badanie wykonuje się według normy ISO 15553:2006 — „Jakość wody — Izolowanie i identyfikacja oocyst Cryptosporidium i cyst Giardia z wody”. Tytuł angielski: „Water quality — Isolation and identification of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water”.
Na czym polega ta metoda?
Izolacja pierwotniaków z wody wymaga zmniejszenia objętości próbki przy zatrzymaniu oocyst i cyst. Norma opisuje dwie techniki zagęszczania — filtrację kapsułową z elucją, a następnie wirowanie z małą prędkością.
Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?
Oznaczane formy: Oocysty Cryptosporidium i cysty Giardia (bez identyfikacji do gatunku i bez oceny żywotności); Objętość próbki: 10–1000 l; przy małych objętościach (10–100 l) próbka punktowa, przy 1000 l filtracja na miejscu poboru; Czas do wykonania badania: Najlepiej w ciągu 24 h od pobrania, nie dłużej niż 4 doby; przechowywanie w (5 ± 3) °C; Wirowanie eluatu: 1100 × g przez 15 min, bez hamowania w fazie wytracania obrotów.
Ile trwa wykonanie badania?
Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 20 min–20 min. Procedura obejmuje 10 kroków.
Jaki sprzęt jest potrzebny?
Kapsuła filtracyjna do zagęszczania próbki, Pompa perystaltyczna, Wytrząsarka nadgarstkowa (wrist-action), Wirówka laboratoryjna, Koncentratory cząstek magnetycznych do IMS, Mikroskop epifluorescencyjny z optyką DIC.
Gdzie stosuje się to badanie?
Kontrola wody przeznaczonej do spożycia z ujęć powierzchniowych i mieszanych (badanie poza obowiązkowym zakresem Dz. U. 2026 poz. 748); Ocena skuteczności uzdatniania — bariery dla form przetrwalnych opornych na chlor; Badanie wód powierzchniowych i podziemnych ujmowanych przez wodociągi; Woda basenowa i rekreacyjna (norma wymienia je wprost w zakresie); Wody mineralne i woda uzdatniona rozprowadzana w sieci; Dochodzenia epidemiologiczne przy podejrzeniu ogniska choroby wodozależnej.
Jakie środki ostrożności obowiązują?
Cryptosporidium i Giardia są chorobotwórcze dla człowieka (choroby jelitowe) — próbki, koncentraty i zawiesiny wzorcowe traktować jako materiał zakaźny; Oocysty Cryptosporidium są oporne na chlor w stężeniach stosowanych do uzdatniania wody — dezynfekcja podchlorynem nie jest wiarygodnym sposobem odkażania sprzętu po pracy z tym materiałem; Zawiesiny wzorcowe przechowywać w (5 ± 3) °C i nigdy nie zamrażać; nie używać zawiesin zbrylonych ani ze słabnącym wybarwieniem; Badanie wykonują wyłącznie analitycy po zdanych testach kompetencji, regularnie sprawdzani na próbkach fortyfikowanych i w zewnętrznych programach badań biegłości; Metanol i rozpuszczalniki stosowane do utrwalania preparatów — praca pod wyciągiem, z dala od źródeł zapłonu, w rękawicach i okularach ochronnych.
Które laboratorium wykona to badanie?
Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy ISO 15553.