🍎 Aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP, EC 3.1.3.1) w mleku surowym i poddanym obróbce cieplnej (pełnym, półtłustym, odtłuszczonym, smakowym) i napojach na bazie mleka krowiego, owczego i koziego oraz w odtworzonym mleku w proszku — ciągły bezpośredni pomiar kinetyczny: niefluorescencyjny substrat fosforan 2′-[2-benzotiazolilo]-6′-hydroksybenzotiazolu w buforze dietanoloaminowym pH 10 hydrolizowany przez ALP do silnie fluoryzującego produktu, odczyt w 38 °C przez 3 min (pierwsza minuta na wyrównanie temperatury), fluorymetr filtrowy z wzbudzeniem 440 nm i emisją 520–560 nm, kalibracja roztworami Fluoroyellow® 0 / 17,24 / 34,48 × 10⁻³ µmol/l; wynik w mU/l do 7000 mU/l, powyżej — rozcieńczenie mlekiem bez ALP (ogrzanym 5 min w 95 °C, < 10 mU/l); PN-EN ISO 11816-1:2024-07

Chemia żywności PN-EN ISO 11816-1

Przegląd

CO TA NORMA OPISUJE. Tekst normy czytamy w próbce iTeh dokumentu ISO 11816-1:2024 | IDF 155-1:2024 (wydanie czwarte, 2024-01, tekst angielski) — PN-EN ISO 11816-1:2024-07 wprowadza EN ISO 11816-1:2024 i ISO 11816-1:2024 jako identyczne (wyszukiwarka PKN): przedmowy ISO i IDF, rozdziały 1–8 i rozdział 9 do punktu 9.1.1 — próbka kończy się na stronie 4. Dalszej części sprawdzania aparatu (9.1.2–9.1.5), kontroli odczynnika roboczego (9.2), kalibracji (9.3), oznaczenia (9.4), kontroli związanych z próbką (9.5, m.in. test na substancje zakłócające i na termostabilną mikrobiologiczną fosfatazę), obliczeń (10), precyzji (11), sprawozdania (12) i załącznika A (badanie międzylaboratoryjne) nie czytamy; tytuły znamy ze spisu treści.

WEDŁUG TEKSTU ISO 11816-1:2024. Normę przygotował ISO/TC 34 „Produkty żywnościowe”, podkomitet SC 5 „Mleko i przetwory mleczne”, wspólnie z IDF i we współpracy z CEN/TC 302 (porozumienie wiedeńskie); prace prowadził zespół IDF/ISO P19. Wydanie czwarte zastępuje wydanie trzecie (ISO 11816-1 | IDF 155-1:2013); główne zmiany: wycofany aparat FLM200 zastąpiono wersją FLM300; zmieniono instrukcje obsługi zgodnie z nowym interfejsem i elektroniką FLM300 — bez zmiany oznaczenia ani procedury badania; blok grzejny jest teraz częścią aparatu. Zakres (1): fluorymetryczne oznaczanie aktywności fosfatazy alkalicznej (EC 3.1.3.1) w mleku surowym i poddanym obróbce cieplnej — pełnym, półtłustym, odtłuszczonym i smakowym; dla mleka i napojów na bazie mleka krowiego, owczego i koziego; także dla mleka w proszku po odtworzeniu; aparat odczytuje aktywność do 7000 mU/l, a próbkę o wyższej aktywności rozcieńcza się mlekiem bez ALP tak, by wynik nie przekraczał 7000 mU/l. Powołań normatywnych brak (2). Definicja (3.1): aktywność ALP — aktywność enzymu w produkcie oznaczona opisaną procedurą, wyrażana w miliunitach na litr próbki (mU/l). Zasada (4): ciągły fluorymetryczny bezpośredni pomiar kinetyczny; niefluorescencyjny aromatyczny monoester fosforanowy — fosforan 2′-[2-benzotiazolilo]-6′-hydroksybenzotiazolu — w obecności ALP z próbki ulega hydrolizie reszty fosforanowej, dając silnie fluoryzujący produkt; pomiar w 38 °C przez 3 min w aparacie Fluorophos® (wstępna inkubacja substratu i próbki, potem wielokrotne odczyty szybkości reakcji); uwaga: pierwsza minuta to wyrównanie temperatury, właściwy pomiar trwa od początku drugiej do końca trzeciej minuty (2 min). Odczynniki (5): odczynniki 5.1–5.5 i aparatura 6.1–6.4 (bez 6.3.3) tworzą system Fluorophos® Test System (nazwy handlowe podano informacyjnie; równoważne produkty dopuszczalne, jeśli dają te same wyniki); substrat Fluorophos® — butelki po 144 mg (580 g/mol), 2 lata w 2–8 °C w nieotwartych butelkach, chroniony przed światłem; bufor dietanoloaminowy c(DEA) = 2,4 mol/l, pH 10,0, butelki po 240 ml, 2 lata w 2–8 °C; substrat roboczy — zawartość butelki buforu (240 ml) dodana do butelki substratu (144 mg), mieszanie przez odwracanie 3 min (ok. 1,0 mmol/l, pH 10), szkło oranżowe, co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej przed użyciem; przydatność sprawdza się testem A/D (9.2) — nie używa się substratu przy odczycie powyżej 1200 FLU; trwałość 60 dni w 2–8 °C w ciemności albo 8 h w 38 °C; 240 ml wystarcza na ok. 115 oznaczeń; roztwory kalibracyjne Fluoroyellow® (2′-(2-benzotiazolilo)-6′-hydroksybenzotiazol) w buforze — A 0, B 17,24 × 10⁻³ i C 34,48 × 10⁻³ µmol/l, 18 miesięcy w 2–8 °C; roztwór do codziennej kontroli aparatu 34,48 × 10⁻³ µmol/l. Aparatura (6): fluorymetr filtrowy z termostatowanym uchwytem kuwet (38 ± 1) °C i optyką pod kątem prostym, wzbudzenie 440 nm, emisja 520–560 nm; jednorazowe kuwety z niefluoryzującego szkła 12 × 75 mm; dozownik 2,0 ml; pipeta wyporowa lub powietrzna 0,075 ml — technika pipetowania jest krytyczna dla dokładności; pipety 2 i 3 ml; blok inkubacyjny (38 ± 1) °C; folia parafinowa; mieszadło typu vortex; łaźnia wodna (63 ± 1) °C i (95 ± 1) °C; kolby pomiarowe 100 ml. Pobieranie (7) nie jest częścią metody — zalecana ISO 707 | IDF 50. Mleko bez ALP (8.1): porcję mleka badanego rodzaju odmierza się do probówki bez kontaktu z brzegiem i ściankami, ogrzewa w łaźni w 95 °C — 5 min od osiągnięcia 95 °C w środku porcji (termometr lub termistor) — i szybko chłodzi; aktywność ALP tak przygotowanego mleka musi być poniżej 10 mU/l. Próbka (8.2): wszystkie próbki starannie miesza się; zwykle nie trzeba ich ogrzewać; próbki pasteryzowane używa się w stanie dostarczonym; próbki o wysokiej aktywności rozcieńcza się mlekiem bez ALP do zakresu analitycznego (< 7000 mU/l). Sprawdzanie aparatu (9.1.1): dryf, światło rozproszone i stabilność przed analizą; codzienny test A/D, codzienny test roztworem kontrolnym (dryf elektroniczny i optyczny) i zalecane zewnętrzne kontrole dodatnie, ujemne i normalne.

STATUS (stan na 03.10.2026). W wyszukiwarce PKN (hasło „PN-EN ISO 11816-1”, 03.10.2026) PN-EN ISO 11816-1:2024-07 figuruje w wersji polskiej i angielskiej, „Wprowadza: EN ISO 11816-1:2024 [IDT], ISO 11816-1:2024 [IDT]”, bez adnotacji o wycofaniu; wcześniejsze wydania (2014-02, 2007, 2006, 2002) mają status „Wycofana i zastąpiona”. Karta PN-EN ISO 11816-1:2014-02 (wersja polska; odczyt 03.10.2026): data publikacji 09-12-2015, data wycofania 01-07-2024, wprowadza EN ISO 11816-1:2013 [IDT] i ISO 11816-1:2013 [IDT], KT 35 „Mleka i Przetworów Mlecznych”, zastąpiona przez PN-EN ISO 11816-1:2024-07 (wersja angielska). Co zmienia wycofanie dla wyniku: według przedmowy ISO 11816-1:2024 zmiany dotyczą aparatu (FLM300 zamiast FLM200, wbudowany blok grzejny) i instrukcji obsługi, bez zmiany oznaczenia ani procedury badania.

ILE LABORATORIÓW I W JAKIEJ POSTACI (kopia bazy zakresów akredytacji, wsad do 17.09.2026, odczyt 03.10.2026). Numer 11816-1 stoi w 2 rekordach u 2 laboratoriów: AB 485 i AB 704. W aktualnych dokumentach PCA (odczyt 03.10.2026; AB 704 wyd. nr 23 z 20.04.2026, AB 485 wyd. nr 27 z 19.08.2026) numer stoi u tych samych 2 laboratoriów; w każdym dokumencie liczba znaczników stron równa się liczbie stron PDF, bez powtórzeń; przeszukanie wszystkich dokumentów PCA pobranych z BIP 03.10.2026 nie dało laboratoriów spoza kopii bazy. Postacie: „PN-EN ISO 11816-1:2024-07” (AB 485) i „PN-EN ISO 11816-1:2014-02” (AB 704 — wydanie wycofane 01.07.2024). Żadna z tych pozycji nie jest zawieszona. Zakładka „Laboratoria” (hasło „PN-EN ISO 11816-1”) pokazuje oba laboratoria — sprawdzone zapytaniem zakładki na serwerze produkcyjnym labcoda.pl 03.10.2026.

CO BADAJĄ LABORATORIA (pozycje w PCA). AB 485: mleko — aktywność fosfatazy alkalicznej (10–7000) mU/l, metoda fluorymetryczna. AB 704: mleko i napoje na bazie mleka — aktywność fosfatazy alkalicznej (10–800) mU/l, metoda fluorymetryczna.

GDZIE ŁATWO O WYNIK POZORNIE POPRAWNY. Przy zakresie: aparat czyta do 7000 mU/l — wyższą aktywność rozcieńcza się mlekiem bez ALP, nie wodą (1, 8.2.3); AB 704 ma zakres do 800 mU/l, więc próbki powyżej tej wartości wymagają rozcieńczenia albo wykraczają poza jego pozycję. Przy mleku do rozcieńczeń: tego samego rodzaju co badane, ogrzane 5 min w 95 °C liczone od osiągnięcia tej temperatury w środku porcji, bez kontaktu mleka z brzegiem i ściankami naczynia, i sprawdzone (< 10 mU/l) (8.1). Przy substracie roboczym: co najmniej 30 min przed użyciem, test A/D — odrzucenie przy odczycie powyżej 1200 FLU; trwałość 60 dni w 2–8 °C albo tylko 8 h w 38 °C (5.3). Przy pipetowaniu: 0,075 ml próbki — technika jest krytyczna dla dokładności (6.3.2). Przy aparacie: codzienny test A/D i roztwór kontrolny 34,48 × 10⁻³ µmol/l przed analizą (9.1.1). Przy wydaniu: AB 704 powołuje wydanie z 2014 r., wycofane 01.07.2024 — według przedmowy nowego wydania procedura się nie zmieniła, zmienił się aparat (przedmowa). Przy innych gatunkach i produktach: metoda dotyczy mleka krowiego, owczego i koziego oraz napojów na jego bazie; mleko w proszku tylko po odtworzeniu (1).

CZEGO NIE PODAJEMY. Procedury kalibracji i oznaczenia (9.2–9.5), wzorów obliczeniowych (10), danych precyzji (11) ani wyników badania międzylaboratoryjnego (załącznik A) nie przytaczamy — leżą poza próbką. Nie podajemy kryteriów oceny skuteczności pasteryzacji na podstawie aktywności ALP.

Zasada metody

Fosfataza alkaliczna z próbki odszczepia resztę fosforanową od niefluorescencyjnego substratu (fosforanu 2′-[2-benzotiazolilo]-6′-hydroksybenzotiazolu), tworząc silnie fluoryzujący produkt. Próbkę z substratem w buforze o pH 10 umieszcza się w fluorymetrze termostatowanym w 38 °C; po minucie wyrównania temperatury aparat przez dwie minuty mierzy przyrost fluorescencji (wzbudzenie 440 nm, emisja 520–560 nm), a szybkość reakcji przelicza na aktywność w mU/l na podstawie kalibracji roztworami fluoryzującego produktu.

Zastosowania

• Mleko surowe i poddane obróbce cieplnej — pełne, półtłuste, odtłuszczone i smakowe (1)
• Mleko i napoje na bazie mleka krowiego, owczego i koziego; mleko w proszku po odtworzeniu (1)
• Mleko oraz mleko i napoje na bazie mleka — aktywność fosfatazy alkalicznej — 2 rekordy zakresów akredytacji 2 laboratoriów w PCA

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 11816-1:2024-07

Tytuł (PL)

Mleko i przetwory mleczne — Oznaczanie aktywności fosfatazy alkalicznej — Część 1: Metoda fluorymetryczna dla mleka i napojów na bazie mleka

Title (EN)

Milk and milk products — Determination of alkaline phosphatase activity — Part 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie substratu roboczego

   Bufor + substrat, 3 min mieszania, ≥ 30 min w temperaturze pokojowej, test A/D ≤ 1200 FLU (5.3). PN-EN ISO 11816-1:2024-07 — bez adnotacji o wycofaniu (PKN, 03.10.2026).

2. Sprawdzenie aparatu

   Codzienny test A/D, roztwór kontrolny, zalecane kontrole zewnętrzne (9.1.1).

3. Mleko bez ALP

   5 min w 95 °C, szybkie chłodzenie, sprawdzenie < 10 mU/l (8.1).

4. Przygotowanie próbki

   Mieszanie; pasteryzowane — bez zmian; wysoka aktywność — rozcieńczenie mlekiem bez ALP (8.2).

5. Pomiar

   38 °C, 3 min, odczyt kinetyczny w mU/l (4); szczegóły kalibracji i oznaczenia — poza próbką (9.3, 9.4).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Substrat, bufor i roztwory kalibracyjne przechowuje się w 2–8 °C i chroni przed światłem; substrat roboczy w szkle oranżowym (5.1–5.4)

Najczęstsze pytania