🦠 Escherichia coli w kosmetykach — wykrywanie po namnażaniu w bulionie Eugon LT 100 i izolacji na agarze MacConkeya

Mikrobiologia PN-EN ISO 21150

Przegląd

ISO 21150:2015 podaje ogólne wytyczne wykrywania i identyfikacji Escherichia coli — mikroorganizmu „specyfikowanego” w produktach kosmetycznych; lista mikroorganizmów specyfikowanych może się różnić między krajami zależnie od praktyki i przepisów. Metoda opiera się na wykrywaniu E. coli w nieselektywnym podłożu płynnym (bulionie namnażającym), a następnie izolacji na selektywnym podłożu agarowym; inne metody mogą być odpowiednie zależnie od wymaganego poziomu wykrywania (np. przesiewy na podłoża nieselektywne i identyfikacja zestawami). Ze względu na różnorodność kosmetyków metoda może nie pasować w każdym szczególe do niektórych produktów (np. niemieszających się z wodą) — wtedy właściwa może być ISO 18415; metody alternatywne (np. automatyczne) można stosować po wykazaniu równoważności. Norma zaleca analizę ryzyka mikrobiologicznego dla ustalenia, do jakich produktów ją stosować; produkty niskiego ryzyka (ISO 29621) to m.in. te o niskiej aktywności wodnej, hydroalkoholowe i o skrajnym pH.

W Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 21150:2016-01 ze zmianą A1:2023-03 (zastąpiła PN-EN ISO 21150:2010). W praktyce laboratoriów badających czystość mikrobiologiczną kosmetyków norma należy do zestawu PN-EN ISO (21149, 16212, 22718, 22717, 18416) stosowanego do badań ilościowych i jakościowych; do weryfikacji obecności E. coli wykonuje się posiew na wybiórczo-różnicujące podłoże MacConkeya, na którym pałeczki te tworzą ciemnoróżowe kolonie z ciemnoróżową obwódką.

Zasada metody

Pierwszy etap to namnażanie w nieselektywnym bulionie, które zwiększa liczbę mikroorganizmów bez ryzyka zahamowania przez składniki selektywne podłoży selektywno-różnicujących; drugi etap (izolacja) prowadzi się na podłożu selektywnym, po czym wykonuje testy identyfikacyjne. Ewentualne hamowanie wzrostu drobnoustrojów przez próbkę musi zostać zneutralizowane, aby umożliwić wykrycie żywych komórek — w każdym przypadku i niezależnie od metodyki neutralizację właściwości przeciwbakteryjnych produktu trzeba sprawdzić i wykazać (rozdz. 11 normy, test przydatności na agarze sojowo-kazeinowym). Próbka to co najmniej 1 g lub 1 ml produktu użyty do sporządzenia zawiesiny wyjściowej. Podłoża wymienione w normie: roztwór tryptonu z chlorkiem sodu jako rozcieńczalnik zawiesiny bakteryjnej, agar sojowo-kazeinowy do testu przydatności, bulion Eugon LT 100 do namnażania (dopuszczalne inne buliony namnażające), agar MacConkeya do izolacji E. coli (zawiera m.in. czerwień obojętną 30,0 mg i fiolet krystaliczny 1,0 mg na litr; po rozpuszczeniu gotuje się 1 min i sterylizuje w 121 °C przez 15 min) oraz agar eozynowo-błękitowy Levine’a (EMB) do potwierdzania (eozyna Y 400 mg i błękit metylenowy 65 mg na litr; do każdych 100 ml upłynnionego agaru dodaje się 5 ml 20 % roztworu laktozy, 2 ml 2 % eozyny Y i 2 ml 0,033 % błękitu metylenowego; sterylizacja 121 °C, 15 min). Wszystkie podłoża sterylizuje się w autoklawie w 121 °C przez 15 min.

Zastosowania

• Kontrola czystości mikrobiologicznej kosmetyków — wykrywanie E. coli jako mikroorganizmu specyfikowanego (produkty na bazie wody: kremy, balsamy, żele)
• Zwalnianie serii produktów kosmetycznych i badania surowców
• Badania stabilności mikrobiologicznej i skuteczności zakonserwowania (w zestawie z PN-EN ISO 21149, 16212, 22717, 22718, 18416)
• Laboratoria kontraktowe i zakładowe branży kosmetycznej; produkty o niskim ryzyku (ISO 29621) po analizie ryzyka

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 21150:2016-01 + A1:2023-03 (ISO 21150:2015 + Amd 1:2022)

Tytuł (PL)

Kosmetyki — Mikrobiologia — Wykrywanie obecności Escherichia coli

Title (EN)

Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli

Procedura krok po kroku

1. Analiza ryzyka i przygotowanie próbki

   Ustal, czy produkt podlega badaniu (analiza ryzyka mikrobiologicznego, ISO 29621). Pobierz co najmniej 1 g lub 1 ml produktu i sporządź zawiesinę wyjściową w bulionie namnażającym z neutralizatorami.

2. Test przydatności (neutralizacja)

   Wykaż, że właściwości przeciwbakteryjne produktu zostały zneutralizowane (rozdz. 11 normy) — z użyciem zawiesiny szczepu odniesienia w roztworze tryptonu z NaCl i agaru sojowo-kazeinowego.

3. Namnażanie

   Inkubuj zawiesinę wyjściową w nieselektywnym bulionie Eugon LT 100 (lub innym bulionie namnażającym dopuszczonym przez normę) w warunkach podanych w normie.

4. Izolacja

   Z namnożonej hodowli posiej agar MacConkeya i inkubuj; szukaj kolonii charakterystycznych dla E. coli (ciemnoróżowe z ciemnoróżową obwódką).

5. Potwierdzenie i identyfikacja

   Kolonie podejrzane przesiej na agar EMB Levine’a i wykonaj testy identyfikacyjne (np. zestawy identyfikacyjne po przesiewie na podłoże nieselektywne).

6. Wynik

   Podaj obecność lub brak E. coli w badanej próbce produktu (1 g lub 1 ml), z informacją o wykazanej neutralizacji.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• E. coli może obejmować szczepy patogenne — praca w warunkach laboratorium mikrobiologicznego, autoklawowanie hodowli
• Barwniki podłoży (fiolet krystaliczny, eozyna, błękit metylenowy) — unikać kontaktu ze skórą, rękawice
• Gorące podłoża po gotowaniu i autoklawowaniu — ryzyko poparzenia

Najczęstsze pytania