🦠 Przesiewowe wykrywanie enterotoksyn gronkowcowych SEA, SEB, SEC, SED i SEE w żywności — 25 g próbki z ok. 40 ml wody w 38 °C homogenizuje się, wytrząsa 30–60 min, zakwasza do pH 3,5–4,0, wiruje (≥ 3130 g, 15 min), zobojętnia do pH 7,4–7,6, ekstrakt zagęszcza dializą w roztworze PEG do 5,0–5,5 g, a toksyny wykrywa komercyjnym zestawem immunoenzymatycznym (np. ELFA, ELISA) spełniającym kryteria: czułość i swoistość powyżej 90 %, LOD50 poniżej 0,06 ng/g; zagęszczanie obowiązkowe dla mleka i przetworów mlecznych, PN-EN ISO 19020

Mikrobiologia PN-EN ISO 19020

Przegląd

CO TA NORMA OPISUJE. Tekst normy czytamy w próbce iTeh dokumentu ISO 19020:2017 (tekst angielski): strona tytułowa, spis treści, przedmowa, wprowadzenie, rozdziały 1–8 i początek rozdziału 9 (kontrola jakości) — próbka kończy się na stronie 6. Punkt 8.7 „Wykrywanie” jest w tekście próbki urwany (zostały dwa zdania o wyborze zestawu i postępowaniu według instrukcji producenta), a w punkcie 2 brakuje części pierwszej pozycji (ISO 3696, woda do analiz, znana z punktu 5.1). Rozdziałów 10–13 (wyrażanie wyników, potwierdzenie, charakterystyka metody, sprawozdanie) i załączników A–C nie czytamy; tytuły znamy ze spisu treści.

WEDŁUG TEKSTU ISO 19020:2017. Dokument przygotował CEN/TC 275 „Analiza żywności — Metody horyzontalne” we współpracy z ISO/TC 34 „Produkty spożywcze”, podkomitet SC 9 „Mikrobiologia” (porozumienie wiedeńskie). Spis treści: 8 Postępowanie (8.1 porcja badana, 8.2 przechowywanie próbki, 8.3 ekstrakcja, 8.4 zagęszczanie ekstraktu — obowiązkowe dla mleka i przetworów mlecznych, 8.5 odzyskanie zagęszczonego ekstraktu, 8.6 przechowywanie przed wykrywaniem, 8.7 wykrywanie, 8.8 kryteria sprawności), 9 Kontrola jakości, 10 Wyrażanie wyników, 11 Potwierdzenie, 12 Charakterystyka metody, 13 Sprawozdanie, załączniki A i B (informacyjne) — wyniki badań międzylaboratoryjnych z 2013 i 2014 r., załącznik C (informacyjny) „Uwaga o interferencjach”. Wprowadzenie: enterotoksyny gronkowcowe (SE) to białka wytwarzane w żywności przez niektóre szczepy gronkowców koagulazo-dodatnich, głównie Staphylococcus aureus; są odporne na ogrzewanie i kwas, wywołują nudności, wymioty, bóle brzucha i biegunkę; ze względu na trwałość mogą być obecne, nawet gdy gronkowców nie da się wykryć; to rodzina ponad 20 białek o masie 19–30 kDa, odpornych na obróbkę cieplną, zamrażanie, zmiany pH i trawienie białek; zatrucie mogą wywołać nanogramowe ilości; Unia Europejska ustaliła kryteria mikrobiologiczne obejmujące liczenie gronkowców koagulazo-dodatnich i wykrywanie SE. Metody chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas są w opracowaniu, dlatego punktem wyjścia normalizacji są metody immunoenzymatyczne (EIA) z komercyjnymi zestawami; kryteria sprawności zestawów oceniono na pięciu rodzajach matryc; dopuszczalną wartość LOD50 ustalono z dawki progowej (BMD) wyznaczonej metodą US EPA z danych o zatruciach, w tym danych laboratorium referencyjnego UE ds. gronkowców koagulazo-dodatnich. Zakres (1): metoda przesiewowa wykrywania enterotoksyn SEA, SEB, SEC, SED i SEE w żywności, w dwóch krokach: ekstrakcja z zagęszczaniem opartym na dializie i wykrywanie immunoenzymatyczne komercyjnym zestawem; dotyczy produktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi; inne enterotoksyny (SEG, SEH, SEI, SER, SES, SET) też wywołują chorobę, ale z braku zestawów norma obejmuje tylko SEA–SEE, a do innych może mieć zastosowanie po walidacji. Powołania (2): ISO 3696 (woda do analiz), ISO 7218 (wymagania ogólne dla badań mikrobiologicznych). Definicje (3): SEA–SEE — egzobiałka szczepów enterotoksygennych o masie 19–30 kDa; swoistość (SP) — liczba wyników ujemnych podzielona przez liczbę badanych próbek ślepych; czułość (SE) — liczba wyników dodatnich podzielona przez liczbę próbek badanych na danym poziomie skażenia; LOD50 — stężenie (ng SE/g), przy którym prawdopodobieństwo wykrycia wynosi 50 %; BMD — dawka czynnika, która prawdopodobnie wywoła objawy u określonego odsetka narażonych. Odczynniki (5): woda według ISO 3696; kwas solny i wodorotlenek sodu (np. 5N, 1N); PBS pH 7,3 ± 0,2 (NaCl/Na2HPO4 145/10 mM); roztwór PEG o masie cząsteczkowej 20 000 g/mol (30 g proszku z 70 ml wody); roztwór do czyszczenia elektrody (np. etanol 70 %); zestaw immunoenzymatyczny do SE spełniający kryteria z 8.8. Aparatura (6): sprzęt mikrobiologiczny według ISO 7218; mikser; waga; homogenizator — zdecydowanie zalecany obrotowy, przy homogenizatorze perystaltycznym tylko worki bez filtra; wytrząsarka; pH-metr; wirówka ≥ 3130 g, najlepiej chłodzona; membrana dializacyjna o granicy odcięcia 6000–8000 Da z zamknięciami; materiał filtracyjny; płaska kuweta; lodówka (3 ± 2) °C lub (5 ± 3) °C i zamrażarka ≤ −18 °C; naczynia ze szkła lub polipropylenu, by uniknąć adsorpcji toksyn; łaźnia wodna (38 ± 2) °C. Pobieranie próbek (7): nie jest częścią metody. Porcja badana (8.1): z sera z skórką ok. 10 % skórki i 90 % wnętrza; toksyny mogą być rozłożone nierównomiernie, więc homogenizuje się całą próbkę lub reprezentatywną część i bierze 25 g; przy podejrzeniu zatrucia pokarmowego porcja może być mniejsza, a stosunek masy porcji do masy zagęszczonego ekstraktu ma wynosić ok. 5 (25 g na 5,0–5,5 g ekstraktu, maks. 5,8 g przy ekstraktach lepkich). Przechowywanie (8.2): zalecane w (3 ± 2) °C lub (5 ± 3) °C; bez analizy w ciągu 24 h — zamrozić, rozmrażać całkowicie w lodówce, unikać wielokrotnego zamrażania. Ekstrakcja (8.3): do 25 g ok. 40 ml wody w 38 °C (produkty płynne bez wody), homogenizacja (szczególnie ważna przy produktach tłustych); wytrząsanie 30–60 min w 18–27 °C; zakwaszenie HCl do pH 3,5–4,0; wirowanie ≥ 3130 g przez 15 min w ok. 4 °C albo w temperaturze pokojowej (przy próbkach tłustych zalecane chłodzenie); po wirowaniu pH ma wynosić 3,0–4,5 — powyżej 4,5 zakwasić ponownie, poniżej 3,0 struktura SE może ulec uszkodzeniu i trzeba wziąć nową porcję; zobojętnienie NaOH do pH 7,4–7,6 — powyżej 9,0 nowa porcja; ponowne wirowanie i odzyskanie całej fazy wodnej. Wariant bez dializy (8.3.10): tylko w szczególnych sytuacjach, np. przy podejrzeniu zatrucia, i nie dla mleka i przetworów mlecznych — przy wyniku ujemnym tego samego dnia zagęszcza się resztę fazy i powtarza wykrywanie. Zagęszczanie (8.4): membrana nawodniona i wypłukana, napełniona całą zobojętnioną fazą przez lejek z filtrem, ułożona w płaskiej kuwecie z roztworem PEG na noc w lodówce; jeśli w membranie zostaje więcej niż 5 ml — dłużej (do 3 dni) albo z dosypaniem PEG. Odzyskanie (8.5): membranę opłukuje się z PEG, ekstrakt wypłukuje PBS (mleko i przetwory mleczne) albo wodą (inne matryce), pocierając wewnętrzne ścianki, do masy 5,0–5,5 g (5,8 g) na 25 g porcji. Przechowywanie ekstraktu (8.6): do 48 h w lodówce, dłużej w ≤ −18 °C. Wykrywanie (8.7, urwane): zestaw spełniający kryteria dla całej procedury, postępowanie według instrukcji producenta. Kryteria (8.8): swoistość i czułość powyżej 90 %, LOD50 poniżej 0,06 ng SE/g — z BMD dla SEA 6,1 ng i spożycia 100 g żywności; z braku danych dla innych typów tę wartość przyjęto także dla SEB–SEE; wartości dla różnych zestawów i matryc z dializą i bez podaje rozdział 12, a laboratoria mają na tej podstawie wybierać zestaw; wyniki badań międzylaboratoryjnych mogą nie dotyczyć innych rodzajów żywności niż w załącznikach A i B. Kontrola jakości (9, początek): zaleca się sprawdzanie całej procedury materiałami odniesienia.

STATUS (stan na 03.10.2026). W wyszukiwarce PKN (hasło „19020”, 03.10.2026) jedynym wynikiem jest PN-EN ISO 19020:2017-08 (wersja angielska, „Wprowadza: EN ISO 19020:2017 [IDT], ISO 19020:2017 [IDT]”), bez adnotacji o wycofaniu. Karta: data publikacji 23.08.2017, 36 stron, KT 3 Mikrobiologii Łańcucha Żywnościowego, ICS 07.100.30, bez adnotacji o wycofaniu. W katalogu iTeh (odczyt 03.10.2026) ISO 19020:2017 ma status „Published”, etap 90.93 (norma międzynarodowa potwierdzona).

ILE LABORATORIÓW I W JAKIEJ POSTACI (kopia bazy zakresów akredytacji, wsad do 17.09.2026, odczyt 03.10.2026). Numer 19020 stoi w 4 rekordach u 4 laboratoriów: AB 377, AB 485, AB 486, AB 598. W aktualnych dokumentach PCA (odczyt 03.10.2026; AB 377 wyd. nr 29 z 12.12.2025, AB 486 wyd. nr 29 z 23.07.2026, AB 598 wyd. nr 36 z 30.07.2026, AB 485 wyd. nr 27 z 19.08.2026) numer stoi w 4 wierszach u tych samych 4 laboratoriów; w każdym dokumencie liczba znaczników stron równa się liczbie stron PDF, bez powtórzeń; przeszukanie wszystkich dokumentów PCA pobranych z BIP 03.10.2026 nie dało laboratoriów spoza kopii bazy. Postać „PN-EN ISO 19020:2017-08” (AB 485), „PN-EN ISO 19020: 2017-08 z wył. pkt 11” (AB 377), „PN-EN ISO 19020 z wyłączeniem pkt. 11” z instrukcją zestawu Vidas Staph Enterotoxin II (SET2) (AB 598) i „PN-EN ISO 19020” (AB 486). Żadna z tych pozycji nie jest zawieszona. Zakładka „Laboratoria” (hasło „PN-EN ISO 19020”) pokazuje wszystkie 4 laboratoria — sprawdzone zapytaniem zakładki na serwerze produkcyjnym labcoda.pl 03.10.2026.

CO BADAJĄ LABORATORIA (pozycje w PCA). Przedmiot: surowe mleko i produkty z mleka surowego, mleko i produkty mleczne poddane obróbce cieplnej, surowe mięso i produkty mięsne oraz drobiowe gotowe do ugotowania, produkty mięsne gotowe do spożycia i do podgrzania i inne kategorie (AB 377); mięso i przetwory mięsne, mleko i przetwory mleczne, ryby i przetwory rybne, jaja i przetwory jajeczne, wyroby garmażeryjne (AB 485); żywność (AB 486, AB 598). Cecha: obecność enterotoksyn gronkowcowych. Technika: metoda enzymoimmunofluorescencyjna (ELFA) z aparatem mini VIDAS (AB 377), ELFA (AB 598), immunoenzymatyczna z aparatem mini VIDAS (AB 486), ELFA lub ELISA (AB 485).

GDZIE ŁATWO O WYNIK POZORNIE POPRAWNY. Przy wyniku ujemnym: norma wykrywa tylko SEA–SEE, a inne enterotoksyny (SEG, SEH, SEI, SER, SES, SET) też wywołują chorobę (1) — wynik ujemny nie wyklucza toksyn spoza tej piątki. Przy zestawie: o wyniku decyduje zestaw, który musi dla całej procedury, z ekstrakcją, spełniać LOD50 < 0,06 ng/g i czułość oraz swoistość > 90 % (8.8); dane z rozdziału 12 dotyczą matryc z badań międzylaboratoryjnych. Przy pH: poniżej 3,0 po zakwaszeniu albo powyżej 9,0 po zobojętnieniu struktura toksyn może ulec uszkodzeniu i porcję trzeba powtórzyć (8.3.6, 8.3.7). Przy mleku: zagęszczanie dializą jest obowiązkowe, a wariant bez dializy niedozwolony (8.3.10, 8.4). Przy naczyniach: szkło lub polipropylen, bo toksyny adsorbują się na innych materiałach (6.12). Przy próbce: wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie powoduje straty toksyn (8.2). Przy wyłączeniu: AB 377 i AB 598 wyłączają punkt 11, który według spisu treści dotyczy potwierdzenia — treści tego punktu nie czytaliśmy.

CZEGO NIE PODAJEMY. Wyrażania wyników, procedury potwierdzenia, danych charakterystyki metody dla poszczególnych zestawów i matryc, wyników badań międzylaboratoryjnych ani uwag o interferencjach (rozdziały 10–13, załączniki A–C) nie przytaczamy — leżą poza próbką. Nie podajemy kryteriów mikrobiologicznych z przepisów.

Zasada metody

Z 25 g próbki (z ok. 40 ml wody w 38 °C) toksyny ekstrahuje się wytrząsaniem, zakwasza do pH 3,5–4,0, wiruje, zobojętnia do pH 7,4–7,6 i wiruje ponownie. Fazę wodną zagęszcza się dializą w membranie 6000–8000 Da zanurzonej w roztworze PEG 20 000, a ekstrakt odzyskuje do 5,0–5,5 g. Enterotoksyny SEA–SEE wykrywa się komercyjnym zestawem immunoenzymatycznym, który dla całej procedury spełnia czułość i swoistość > 90 % oraz LOD50 < 0,06 ng/g.

Zastosowania

• Przesiewowe wykrywanie enterotoksyn gronkowcowych SEA, SEB, SEC, SED i SEE w produktach przeznaczonych do spożycia przez ludzi (1)
• Podejrzenie zatrucia pokarmowego — mniejsza porcja i wariant bez dializy, ale nie dla mleka i przetworów mlecznych (8.1, 8.3.10)
• Mleko i produkty mleczne, mięso, drób, ryby, jaja, wyroby garmażeryjne, żywność ogólnie — pozycje w zakresach akredytacji 4 laboratoriów w PCA

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 19020:2017-08

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda immunoenzymatycznego wykrywania enterotoksyn gronkowcowych w żywności

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the immunoenzymatic detection of staphylococcal enterotoxins in foodstuffs

Procedura krok po kroku

1. Porcja badana

   25 g zhomogenizowanej próbki (ser: 10 % skórki, 90 % wnętrza); przechowywanie w lodówce, bez wielokrotnego zamrażania (8.1, 8.2). PN-EN ISO 19020:2017-08 bez adnotacji o wycofaniu w PKN (03.10.2026).

2. Ekstrakcja

   Ok. 40 ml wody 38 °C, homogenizacja, wytrząsanie 30–60 min (8.3.1–8.3.3).

3. Oczyszczanie pH

   Zakwaszenie do pH 3,5–4,0, wirowanie, kontrola pH 3,0–4,5, zobojętnienie do 7,4–7,6, wirowanie (8.3.4–8.3.9).

4. Zagęszczanie

   Dializa w PEG na noc w lodówce; odzyskanie ekstraktu PBS lub wodą do 5,0–5,5 g (8.4, 8.5).

5. Wykrywanie

   Zestaw immunoenzymatyczny spełniający kryteria 8.8, według instrukcji producenta (8.7, 8.8).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Enterotoksyny gronkowcowe — praca w laboratorium mikrobiologicznym według ISO 7218, unikanie aerozoli
• Kwas solny i wodorotlenek sodu w stężeniach 5N — żrące, ochrona oczu i rąk

Najczęstsze pytania