🦠 Najbardziej prawdopodobna liczba (NPL) enterokoków kałowych w wodach powierzchniowych, kąpieliskowych i ściekach metodą zminiaturyzowaną — rozcieńczenia próbki w specjalnym rozcieńczalniku z solą morską, po 200 µl do studzienek 96-dołkowych mikropłytek z odwodnionym podłożem MUD/SF, inkubacja 36–72 h w 44 °C ± 0,5 °C, studzienki z niebieską fluorescencją w UV 366 nm dodatnie, wynik NPL/100 ml z przedziałem ufności 95 %, PN-EN ISO 7899-1

Mikrobiologia PN-EN ISO 7899-1

Przegląd

CO TA NORMA OPISUJE. Zakres z karty PKN PN-EN ISO 7899-1:2002 (wersja polska), w całości: „Opisano metodę oznaczania większości enterokoków kałowych w wodach powierzchniowych i ściekach oraz sposób oznaczania ilościowego tych bakterii przez określenie najbardziej prawdopodobnej ich liczby - NPL”. Tekst normy czytamy w próbce ISO 7899-1:1998: przedmowa, wprowadzenie i rozdziały 4–10 (zasada, aparatura, pobieranie, podłoża, procedura, wyrażanie wyników, sprawozdanie); strona z rozdziałami 1–3 (zakres, powołania normatywne, definicje) jest w próbce pusta, a załączników A–G (programy do obliczania NPL, tablice, skład soli morskiej, kryteria jakości podłoża w mikropłytkach — E, przygotowanie mikropłytek kalibracyjnych — F) nie mamy.

WEDŁUG TEKSTU ISO 7899-1:1998 (przedmowa, wprowadzenie, rozdziały 4–10). Normę przygotował ISO/TC 147 „Water quality”, podkomitet SC 4 „Biological methods”; drugie wydanie zastąpiło pierwsze (ISO 7899-1:1984). Seria ISO 7899: część 1 — metoda zminiaturyzowana NPL przez posiew na podłoże płynne, część 2 — metoda filtracji membranowej; załączniki E i F są normatywne, A, B, C, D i G informacyjne. Wprowadzenie: celem jest oznaczenie głównych enterokoków jelitowych — E. faecalis, E. faecium, E. durans i E. hirae — występujących często w kale ludzi i zwierząt stałocieplnych; okazjonalnie wykrywa się inne gatunki kałowe (E. avium, E. cecorum, E. columbae, E. gallinarum) i szczepy Streptococcus bovis/equinus, rzadkie w próbkach środowiskowych i słabo odzyskiwane; gatunki niekałowe E. casseliflavus i E. mundtii (np. z materii roślinnej i niektórych ścieków przemysłowych) liczy się jako enterokoki kałowe — zwykle dają żółty barwnik na podłożu nieselektywnym — co trzeba uwzględnić przy interpretacji. Zasada (rozdział 4): rozcieńczoną próbkę posiewa się do rzędu studzienek mikropłytki z odwodnionym podłożem; po 36–72 h inkubacji w 44 °C ± 0,5 °C płytki ogląda się w ciemności w świetle UV 366 nm; obecność enterokoków wskazuje fluorescencja z hydrolizy MUD (4-metyloumbeliferylo-β-D-glukozydu); wynik podaje się jako NPL/100 ml. Aparatura (rozdział 5; szkło sterylizowane według ISO 8199): sterylizator suchym gorącem albo autoklaw; cieplarka 44 °C ± 0,5 °C; suszarka tunelowa albo komora z laminarnym przepływem pionowym (najlepiej klasy II); komora do obserwacji w UV (lampa Wooda 366 nm) — ostrzeżenie: UV podrażnia skórę i oczy, rękawice i okulary; refraktometr przenośny (opcjonalnie); pH-metr ±0,1; probówki 16 × 160 mm i 20 × 200 mm; 8-kanałowa pipeta wielokanałowa albo inny system dozujący 200 µl na studzienkę i sterylne końcówki; zestaw do filtracji membranowej z sączkami 0,2 µm do sterylizacji podłoży; sterylne 96-dołkowe mikropłytki 350 µl, płaskodenne, niefluoryzujące; sterylne taśmy samoprzylepne do zaklejania; sterylne płytki Petriego 90 mm. Pobieranie (rozdział 6): według ISO 8199 oraz ISO 5667-1, -2 i -3. Podłoża i rozcieńczalniki (rozdział 7): ze składników o jednolitej jakości albo gotowych odwodnionych; woda destylowana albo demineralizowana bez substancji hamujących lub pobudzających wzrost; nieużyte od razu — w ciemności w (5 ± 3) °C do jednego miesiąca. Specjalny rozcieńczalnik SD (7.2.1): syntetyczna sól morska 22,5 g, opcjonalnie 10 ml roztworu błękitu bromofenolowego (0,04 g w 100 ml etanolu 50 % — tylko do zabarwienia, by nie pomylić z wodą), woda do 1000 ml; autoklawowanie 121 °C ± 3 °C przez 15–20 min; czysty roztwór NaCl się nie nadaje (wyraźne hamowanie); typowy skład soli morskiej — załącznik C. Podłoże MUD/SF (7.3): roztwór A — tryptoza 40 g, KH2PO4 10 g, D(+)-galaktoza 2 g, polioksyetylenosorbitan monooleinian (Tween 80) 1,5 ml, woda 900 ml, rozpuszczone na gorąco i doprowadzone do wrzenia; roztwór B — NaHCO3 4 g, kwas nalidyksowy 250 mg, woda 50 ml; roztwór C — octan talu(I) 2 g, chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoliowy 0,1 g, woda 50 ml; roztwór D — MUD 150 mg w 2 ml N,N-dimetyloformamidu; ostrzeżenie: octan talu i N,N-dimetyloformamid są toksyczne — praca pod wyciągiem; przygotowanie: zmieszanie A + B + C + D, pH 7,5 ± 0,2, sterylizacja przez filtrację 0,2 µm, rozlanie po 100 µl do studzienek mikropłytek (pojemność co najmniej 350 µl) i natychmiastowe odwodnienie w suszarce tunelowej albo komorze laminarnej; produkcja podłoża musi spełniać kryteria jakości z załącznika E. Wybór rozcieńczeń (8.1, tablica 1, odczytana z obrazu strony 4): woda w kąpieliskach — 2 rozcieńczenia: 64 studzienki 1/2 i 32 studzienki 1/20, granice pomiaru 15 do 3,5 × 10⁴ bakterii/100 ml; inne wody powierzchniowe — 4 rozcieńczenia po 24 studzienki (1/2, 1/20, 1/200, 1/2000), 40 do 3,2 × 10⁶/100 ml; ścieki i oczyszczalnie — 6 rozcieńczeń: 16 studzienek 1/2 do 16 studzienek 1/200 000, 60 do 6,7 × 10⁸/100 ml. Rozcieńczenia (8.2; najlepiej w komorze bezpieczeństwa biologicznego — aerozole): wody słodkie i słonawe (zasolenie < 30 g/kg, refraktometrem) — po 9 ml rozcieńczalnika SD w probówkach, 9 ml wymieszanej próbki do pierwszej probówki (1/2), 1 ml do drugiej (1/20), dalej co 1/10; woda morska (zasolenie > 30 g/kg) — w pierwszej probówce 9 ml wody destylowanej albo demineralizowanej zamiast SD, w następnych SD. Posiew (8.3.1): zawartość probówki wylewa się na sterylną płytkę Petriego (co najmniej 90 mm) i pipetą 8-kanałową rozdziela po 200 µl do studzienek odpowiadających temu rozcieńczeniu, zmieniając płytkę i końcówki przy każdym rozcieńczeniu; uwaga na przelewanie się między studzienkami. Inkubacja (8.3.2): płytkę zakleja się sterylną taśmą i inkubuje w 44 °C ± 0,5 °C co najmniej 36 h i najwyżej 72 h, bez przechylania. Odczyt (8.4): płytki z taśmą w komorze UV; dodatnie są studzienki z niebieską fluorescencją; odczyt możliwy w dowolnym czasie po 36 h, bo fluorescencja się nie zmienia. Wyniki (rozdział 9): dla każdego rozcieńczenia liczba dodatnich studzienek; liczba charakterystyczna, np. kąpielisko 64+/64 i 5+/32 → 32/5; wody powierzchniowe 24/24, 18/24, 5/24, 1/24 → 18/5/1; ścieki 16, 16, 12, 5, 0, 0 (na 16) → 12/5/0; przy trzech i więcej rozcieńczeniach — liczba trzycyfrowa, w miarę możliwości kończąca się na 0, według ISO 8199. NPL to statystyczne oszacowanie gęstości przy założeniu rozkładu Poissona, z przedziałem ufności; programy z załączników A albo B podają NPL na mililitr i przedział 95 %; przykłady: 32/5 → 7,56/ml, przedział 5,42–10,54, czyli 756/100 ml (542–1054); 18/5/1 → 159,08/ml (101,99–248,11); 12/5/0 → 1724,61/ml (1003,98–2962,50); bez dodatnich studzienek wynik „< n/100 ml”, gdzie n to NPL dla jednej dodatniej studzienki w zastosowanym układzie. Sprawozdanie (rozdział 10): dane identyfikujące próbkę, metoda i wyniki.

STATUS (stan karty na 02.10.2026). Karta PN-EN ISO 7899-1:2002 (wersja polska) nie ma nagłówka „Wycofana” — norma jest AKTUALNA: publikacja 20-12-2002, 45 stron, grupa cenowa S, Sektor Zdrowia, Środowiska i Medycyny, KT 120 Jakości Wody — Badania Mikrobiologiczne i Biologiczne, ICS 07.100.20, „Wprowadza: EN ISO 7899-1:1998 [IDT], EN ISO 7899-1:1998/AC:2000 [IDT], ISO 7899-1:1998/Cor 1:2000 [IDT], ISO 7899-1:1998 [IDT]”. Wyszukiwarka PKN pod hasłem „PN-EN ISO 7899-1” (02.10.2026) pokazuje tylko tę kartę. Treści poprawki Cor 1:2000 nie znamy. Czy ISO pracuje nad nowym wydaniem, nie sprawdzaliśmy (iso.org odmawia dostępu z naszego serwera).

AKT PRAWNY. Dyrektywa 2006/7/WE dotycząca zarządzania jakością wody w kąpieliskach, załącznik I (tekst pierwotny i najnowsza wersja skonsolidowana w bazie CELLAR, 01.01.2014): dla enterokoków jelitowych metodami referencyjnymi analizy są „ISO 7899-1 lub ISO 7899-2”; wartości dla wód śródlądowych: jakość doskonała 200, dobra 400 (95. percentyl), dostateczna 330 (90. percentyl) jtk/100 ml; dla wód przybrzeżnych i przejściowych 100, 200 i 185 jtk/100 ml. Polskiego rozporządzenia o nadzorze nad jakością wody w kąpieliskach nie czytaliśmy — nie podajemy, jak przenosi te metody.

ILE LABORATORIÓW I W JAKIEJ POSTACI (kopia bazy zakresów akredytacji, wsad do 17.09.2026, odczyt 02.10.2026). Numer 7899-1 stoi w 8 rekordach u 8 laboratoriów: AB 216, AB 313, AB 521, AB 560, AB 565, AB 589, AB 631, AB 680. W aktualnych zakresach na stronach PCA (odczyt 02.10.2026, wydania od 11.07.2025 do 07.08.2026) numer stoi u wszystkich 8 jako „PN-EN ISO 7899-1:2002”, u AB 313 zapisany „PN-EN-ISO 7899-1:2002” (z łącznikiem po EN). Żaden wiersz nie jest złożony pogrubioną kursywą. Zakładka „Laboratoria” szuka zapisów ZACZYNAJĄCYCH SIĘ od wpisanego tekstu: pod „PN-EN ISO 7899-1” pokazuje 7 laboratoriów i 7 pozycji, pod „PN-EN-ISO 7899-1” — AB 313 — sprawdzone zapytaniami zakładki na serwerze produkcyjnym labcoda.pl 02.10.2026.

CO BADAJĄ LABORATORIA (pozycje w PCA). Woda, woda w kąpieliskach i miejscach okazjonalnie wykorzystywanych do kąpieli (AB 216, AB 313, AB 521), woda powierzchniowa (AB 560, AB 589), woda (AB 565, AB 631, AB 680) — „najbardziej prawdopodobna liczba enterokoków kałowych, metoda zminiaturyzowana (NPL)”; u AB 680 „enterokoków (paciorkowców kałowych)”. Wszędzie w sąsiedniej pozycji stoi PN-EN ISO 9308-3:2002 (NPL Escherichia coli, metoda zminiaturyzowana).

GDZIE ŁATWO O WYNIK POZORNIE POPRAWNY. Przy rozcieńczalniku: rozcieńczalnik SD zawiera sól morską — czysty roztwór NaCl wyraźnie hamuje wzrost; przy wodzie morskiej (zasolenie > 30 g/kg) pierwsze rozcieńczenie robi się wodą destylowaną, nie SD. Przy układzie rozcieńczeń: liczba rozcieńczeń i studzienek zależy od rodzaju wody (tablica 1) — układ dla kąpieliska (granica górna 3,5 × 10⁴) przy ściekach daje wynik „ponad zakres”. Przy odczycie: wynik dodatni to niebieska fluorescencja w UV 366 nm, w ciemności; gatunki niekałowe (E. casseliflavus, E. mundtii) też dają wynik dodatni — przy wodach z materią roślinną albo ściekami przemysłowymi zawyżają liczbę „enterokoków kałowych”. Przy obliczeniu: liczbę charakterystyczną wybiera się według ISO 8199 (przy trzech rozcieńczeniach — trzy cyfry, w miarę możliwości końcowe 0); NPL z programu podaje się na ml — przeliczenie na 100 ml i przedział ufności trzeba podać razem. Przy podłożu: produkcja mikropłytek musi spełniać kryteria z załącznika E — płytki niespełniające kryteriów dają NPL pozornie poprawne. Przy pracy: octan talu i N,N-dimetyloformamid są toksyczne.

CZEGO NIE PODAJEMY. Nie mamy rozdziałów 1–3 (pusta strona w próbce) ani załączników A–G — nie podajemy więc tablic NPL, programów obliczeniowych, kryteriów jakości podłoża w mikropłytkach (załącznik E), przygotowania mikropłytek kalibracyjnych (załącznik F) ani danych o precyzji.

Zasada metody

Rozcieńczoną próbkę wody wprowadza się po 200 µl do studzienek mikropłytek z odwodnionym podłożem MUD/SF; po 36–72 h w 44 °C enterokoki hydrolizują 4-metyloumbeliferylo-β-D-glukozyd, a studzienki fluoryzują na niebiesko w świetle UV 366 nm; z liczby dodatnich studzienek w kolejnych rozcieńczeniach oblicza się najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL) na 100 ml z przedziałem ufności 95 %.

Zastosowania

• Woda w kąpieliskach i miejscach okazjonalnie wykorzystywanych do kąpieli — enterokoki jelitowe; dyrektywa 2006/7/WE wskazuje ISO 7899-1 albo ISO 7899-2 jako metody referencyjne
• Wody powierzchniowe — NPL enterokoków kałowych (4 rozcieńczenia, 40 do 3,2 × 10⁶/100 ml)
• Ścieki i oczyszczalnie — do 6 rozcieńczeń (60 do 6,7 × 10⁸/100 ml)
• Woda morska i słonawa — osobny sposób rozcieńczania przy zasoleniu > 30 g/kg

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 7899-1:2002 (wersja polska; EN ISO 7899-1:1998 z AC:2000 IDT, ISO 7899-1:1998 z Cor 1:2000 IDT)

Tytuł (PL)

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych — Część 1: Zminiaturyzowana metoda do badania wód powierzchniowych i ścieków (najbardziej prawdopodobna liczba bakterii)

Title (EN)

Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci in surface and waste water — Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid medium

Procedura krok po kroku

1. Próbka i rozcieńczenia

   Pobranie według ISO 8199 i ISO 5667; układ rozcieńczeń według tablicy 1; wody słodkie i słonawe — SD od pierwszej probówki, woda morska (> 30 g/kg) — pierwsza probówka z wodą destylowaną. PN-EN ISO 7899-1:2002 aktualna (stan karty na 02.10.2026).

2. Posiew

   Każde rozcieńczenie wylane na sterylną płytkę Petriego i rozdzielone pipetą 8-kanałową po 200 µl do studzienek z podłożem MUD/SF; nowa płytka i końcówki dla każdego rozcieńczenia.

3. Inkubacja

   Zaklejenie płytki sterylną taśmą; 44 °C ± 0,5 °C przez 36–72 h, bez przechylania.

4. Odczyt

   W komorze UV 366 nm, w ciemności, płytka z taśmą; studzienki z niebieską fluorescencją — dodatnie.

5. Obliczenie

   Liczba charakterystyczna według ISO 8199; NPL na ml i przedział 95 % z programu (załącznik A albo B), przeliczenie na 100 ml; brak dodatnich — „< n/100 ml”.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Norma ostrzega: octan talu i N,N-dimetyloformamid są toksyczne (wyciąg chemiczny), UV podrażnia skórę i oczy (rękawice, okulary); rozcieńczanie i pipetowanie najlepiej w komorze bezpieczeństwa biologicznego (aerozole); próbki ścieków — materiał zakaźny
• UWAGA MERYTORYCZNA: gatunki niekałowe (E. casseliflavus, E. mundtii) liczą się jako enterokoki kałowe — przy wodach z materią roślinną i ściekami przemysłowymi trzeba to uwzględnić w interpretacji; czysty NaCl zamiast soli morskiej hamuje wzrost

Najczęstsze pytania