🦠 Enterokoki jelitowe w wodzie — metoda NPL z podłożem enzymatycznym (β-D-glukozydaza; Enterolert-DW / Quanti-Tray)

Mikrobiologia PN-EN ISO 7899-3

Przegląd

ISO 7899-3:2025 określa metodę oznaczania ilościowego enterokoków jelitowych w wodzie — w tym Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans, E. avium, E. gallinarum, E. hirae i E. casseliflavus — opartą na wzroście organizmów docelowych w podłożu płynnym i obliczeniu najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) z tablic lub programów. Stosuje się ją do wody do spożycia i wody w kąpieliskach (słodkiej i morskiej) oraz innych podobnych wód, także zawierających znaczną ilość zawiesiny; pozwala wykryć enterokoki na poziomie 1 jtk/100 ml z wynikiem ostatecznym w ciągu (26 ± 2) h nawet przy wysokiej liczbie bakterii heterotroficznych. Wody w kąpieliskach najlepiej badać po rozcieńczeniu 1:10. Test opiera się na ekspresji enzymu β-D-glukozydazy i daje wynik potwierdzony po 24 h bez dalszego badania dodatnich studzienek. Norma nie dotyczy wód butelkowanych, dla których metoda nie była walidowana — laboratorium może ją tam stosować po własnej walidacji. Norma opiera się na zwalidowanym produkcie o ustalonych charakterystykach (załącznik C) i wymaga stosowania ISO 8199, ISO 11133 i ISO 19458 (pobieranie). Obecność enterokoków jelitowych służy ocenie skuteczności uzdatniania w produkcji wody do spożycia oraz wskazuje na przenikanie zanieczyszczeń i nieszczelności w systemach magazynowania i dystrybucji.

Producent podłoża Enterolert-DW (IDEXX) opisuje test jako oparty na technologii zdefiniowanych substratów (DST) ze wskaźnikowym substratem odżywczym orto-nitrofenylo-β-D-glukozydem: gdy enterokoki metabolizują substrat, zabarwienie próbki zmienia się z niebieskiego na zielone — każda zmiana na zielony jest wynikiem dodatnim, bez potrzeby lampy UV. Inkubacja w 41 ± 0,5 °C przez 24 h, wyniki ważne do 28 h (o ile przepisy lokalne nie stanowią inaczej); wynik dodatni przed 24 h jest ważny, ujemny po 28 h — także. Podłoże przechowuje się w 2–25 °C bez światła i wilgoci; test jest przeznaczony do wody pitnej, do innych wód po walidacji laboratoryjnej. W Polsce norma obowiązuje jako PN-EN ISO 7899-3:2025-11.

Zasada metody

Enterokoki jelitowe rosną w podłożu płynnym zawierającym wskaźnikowy substrat odżywczy dla β-D-glukozydazy; rozkład substratu (orto-nitrofenylo-β-D-glukozydu) zmienia barwę podłoża z niebieskiej na zieloną. Próbkę z podłożem rozlewa się do tacki Quanti-Tray, zgrzewa i inkubuje; po (26 ± 2) h (producent: 41 ± 0,5 °C przez 24 h, odczyt do 28 h) liczy się studzienki zielone jako dodatnie — bez dalszego potwierdzania — i z tablic NPL lub programu (np. generator NPL producenta) odczytuje najbardziej prawdopodobną liczbę enterokoków jelitowych na 100 ml. Metoda wykrywa 1 jtk/100 ml w obecności wysokiej liczby bakterii heterotroficznych; wody w kąpieliskach (słodkie i morskie) rozcieńcza się 1:10. Podłoże jest gotowe do użytku w opakowaniach jednostkowych, nie zawiera składników toksycznych; do porównań przy odczycie używa się kontroli ujemnej (brak wzorca barwy). Zasady ogólne badań hodowlanych (ISO 8199), jakości podłoży (ISO 11133) i pobierania próbek (ISO 19458) obowiązują.

Zastosowania

• Woda do spożycia — kontrola skuteczności uzdatniania i szczelności sieci dystrybucyjnej (wynik po 24 h)
• Wody w kąpieliskach słodkie i morskie (rozcieńczenie 1:10), wody z dużą ilością zawiesiny
• Wody o wysokim tle bakterii heterotroficznych, gdzie filtracja membranowa (ISO 7899-2) jest utrudniona
• Laboratoria wodociągów i stacji sanitarno-epidemiologicznych — brak potwierdzania dodatnich studzienek
• Wody butelkowane — wyłącznie po własnej walidacji laboratorium (poza zakresem normy)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 7899-3:2025-11 (ISO 7899-3:2025)

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe enterokoków jelitowych — Część 3: Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

Title (EN)

Water quality — Enumeration of intestinal enterococci — Part 3: Most probable number method

Procedura krok po kroku

1. Pobór

   Pobierz próbkę wg ISO 19458; wody w kąpieliskach (słodkie i morskie) rozcieńcz 1:10.

2. Dodanie podłoża

   Do próbki w jałowym naczyniu dodaj odczynnik Enterolert-DW, zakorkuj i potrząśnij, aby wymieszać zawartość do rozpuszczenia.

3. Rozlanie i zgrzanie

   Wlej próbkę z podłożem do tacki Quanti-Tray i zgrzej w zgrzewarce.

4. Inkubacja

   Inkubuj (26 ± 2) h; wg producenta 41 ± 0,5 °C przez 24 h, odczyt ważny do 28 h.

5. Odczyt

   Za dodatnie uznaj studzienki, w których barwa zmieniła się z niebieskiej na zieloną (każda zmiana na zielony); porównuj z kontrolą ujemną. Wynik dodatni przed 24 h jest ważny; brak zieleni po 28 h to ważny wynik ujemny, zielone zabarwienie po 28 h wymaga powtórzenia.

6. Obliczenie i sprawozdanie

   Z liczby dodatnich studzienek odczytaj NPL enterokoków jelitowych na 100 ml z tablic lub programu NPL; przy rozcieńczeniu uwzględnij współczynnik. Podaj metodę, identyfikację próbki i wynik.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Enterokoki jelitowe wskazują zanieczyszczenie kałowe — praca w warunkach laboratorium mikrobiologicznego, autoklawowanie zużytych tacek
• Zgrzewarka nagrzewa się — nie dotykać elementów grzejnych
• Podłoże nie zawiera składników toksycznych (wg producenta); zachować ogólne zasady BHP przy odczynnikach

Najczęstsze pytania