🦠 Enterobacteriaceae w żywności i paszach — wykrywanie z namnażaniem w BPW i izolacją na agarze VRBG

Mikrobiologia PN-EN ISO 21528-1

Przegląd

ISO 21528-1:2017 określa metodę z namnażaniem do wykrywania Enterobacteriaceae. Stosuje się ją do produktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt oraz do próbek środowiskowych z obszaru produkcji pierwotnej, produkcji i obrotu żywnością. Metoda jest właściwa wtedy, gdy poszukiwane mikroorganizmy prawdopodobnie wymagają ożywienia przez namnażanie oraz gdy ich spodziewana liczba jest poniżej 100 w mililitrze lub gramie próbki. Ograniczeniem jest podatność metody na dużą zmienność (rozdz. 11 normy). Oznaczenie liczby można wykonać metodą najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) po inkubacji w podłożu płynnym (załącznik A). Norma została zwalidowana dla naważek 10 g lub 10 ml.

Temperatura 37 °C dla namnażania i izolacji jest stosowana, gdy Enterobacteriaceae bada się jako wskaźnik higieny; 30 °C wybiera się do celów technologicznych, gdy trzeba objąć także Enterobacteriaceae psychrotrofowe. Do oznaczania liczby Enterobacteriaceae metodą liczenia kolonii służy część 2 normy (ISO 21528-2) — to ją rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 wskazuje jako metodę referencyjną w kryteriach higieny procesu (m.in. tusze po wytrzewieniu). W Polsce część 1 obowiązuje jako PN-EN ISO 21528-1:2017-08; wcześniejsza PN-ISO 21528-1:2005 dotyczyła wykrywania i oznaczania liczby metodą NPL z przednamnażaniem. W dydaktyce mikrobiologii żywności (UWM) ten sam schemat — zbuforowana woda peptonowa 37 °C/18 h, izolacja na VRBG 37 °C/24 h, kolonie ciemnoczerwone, potwierdzenie oksydazą (brak zmiany barwy w 10 s) i fermentacją glukozy — opisywany jest jako standardowa droga wykrywania pałeczek z tej rodziny.

Zasada metody

Zbuforowaną wodę peptonową (BPW) inokuluje się naważką i inkubuje w 37 °C (lub 30 °C) przez 18 h; typowo 10 g próbki miesza się z 90 ml BPW, uzyskując rozcieńczenie dziesięciokrotne. Po namnażaniu hodowlę posiewa się ezą na powierzchnię agaru z fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i glukozą (VRBG) i inkubuje w 37 °C; płytki ogląda się po 24 h w poszukiwaniu typowych kolonii przypuszczalnych Enterobacteriaceae — różowych do czerwonych lub purpurowych, z otoczką wytrąconej żółci lub bez niej. Wybrane kolonie (co najmniej jedną typową lub podejrzaną, przy wyniku ujemnym do czterech kolejnych; po jednej z każdej morfologii) przesiewa się na podłoże nieselektywne (np. agar odżywczy, 37 °C, 24 h ± 2 h) i potwierdza dwoma testami: reakcją oksydazową (bibuła nasączona odczynnikiem oksydazowym lub gotowe krążki; test ujemny, gdy w ciągu 10 s nie pojawi się ciemnoniebieskofioletowe zabarwienie; ezą platynowo-irydową, nigdy niklowo-chromową) oraz testem fermentacji glukozy — kolonie oksydazo-ujemne wkłuwa się do podłoża OF z glukozą, przykrywa co najmniej 1 cm jałowego oleju mineralnego i inkubuje w 37 °C przez 24 h ± 2 h; żółte zabarwienie całej zawartości probówki oznacza reakcję dodatnią. Niektóre Enterobacteriaceae odbarwiają kolonie lub podłoże, dlatego przy braku kolonii charakterystycznych do potwierdzeń wybiera się kolonie białawe. Wynik podaje się jako Enterobacteriaceae wykryte lub niewykryte w naważce x g lub x ml produktu albo na wymazanej powierzchni.

Zastosowania

• Żywność i pasze, w których spodziewana liczba Enterobacteriaceae jest poniżej 100/g lub 100/ml lub komórki wymagają ożywienia (produkty po obróbce cieplnej, suszone, mrożone)
• Próbki środowiskowe z produkcji pierwotnej, zakładów produkcji i obrotu żywnością (wymazy z powierzchni, sprzętu)
• Wskaźnik higieny procesu — namnażanie i izolacja w 37 °C
• Cele technologiczne z uwzględnieniem Enterobacteriaceae psychrotrofowych — wariant w 30 °C
• Półilościowo: oznaczenie NPL po inkubacji w podłożu płynnym (załącznik A normy)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 21528-1:2017-08 (ISO 21528-1:2017)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobacteriaceae — Część 1: Wykrywanie Enterobacteriaceae

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 1: Detection of Enterobacteriaceae

Procedura krok po kroku

1. Naważka i zawiesina wyjściowa

   Odważ naważkę (norma zwalidowana dla 10 g lub 10 ml) i wymieszaj z dziewięciokrotną objętością BPW (np. 10 g + 90 ml), uzyskując rozcieńczenie dziesięciokrotne; mniejsze naważki dopuszczalne wg normy.

2. Namnażanie

   Inkubuj zawiesinę wyjściową w 37 °C (lub 30 °C dla celów technologicznych) przez 18 h ± 2 h.

3. Izolacja na VRBG

   Ezą posiej z namnożonej hodowli powierzchnię płytki z agarem VRBG i inkubuj w 37 °C przez 24 h ± 2 h.

4. Wybór kolonii

   Zaznacz kolonie podejrzane (różowe do czerwonych lub purpurowe, z otoczką wytrąconej żółci lub bez). Wybierz co najmniej jedną typową kolonię; jeśli potwierdzenie wypadnie ujemnie — do czterech kolejnych. Przy kilku morfologiach — po jednej z każdej; przy braku kolonii charakterystycznych — kolonie białawe.

5. Przesiew

   Każdą wybraną kolonię posiej na podłoże nieselektywne (np. agar odżywczy) i inkubuj w 37 °C przez 24 h ± 2 h; do testów weź dobrze izolowaną kolonię.

6. Test oksydazowy

   Ezą platynowo-irydową, drutem lub bagietką szklaną rozetrzyj część kolonii na bibule nasączonej odczynnikiem oksydazowym (lub na krążku handlowym). Reakcja ujemna, gdy bibuła nie zabarwi się na ciemnoniebieskofioletowo w ciągu 10 s.

7. Test fermentacji glukozy

   Kolonie oksydazo-ujemne wkłuj drutem do probówek z podłożem OF z glukozą, przykryj warstwą co najmniej 1 cm jałowego oleju mineralnego i inkubuj w 37 °C przez 24 h ± 2 h. Żółte zabarwienie całej zawartości probówki = reakcja dodatnia.

8. Wynik

   Kolonie oksydazo-ujemne i fermentujące glukozę uznaj za Enterobacteriaceae. Podaj: wykryto / nie wykryto w naważce x g lub x ml produktu albo na wymazanej powierzchni.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Enterobacteriaceae obejmują patogeny jelitowe (Salmonella, E. coli patogenne) — praca w warunkach laboratorium mikrobiologicznego, dezynfekcja i autoklawowanie zużytych hodowli
• Olej mineralny i odczynnik oksydazowy — unikać kontaktu ze skórą i oczami
• Podłoża agarowe w 47–50 °C — ryzyko poparzenia przy rozlewaniu

Najczęstsze pytania