🦠 Enterobacteriaceae w żywności
Oznaczanie liczby Enterobacteriaceae w żywności metodą posiewu zalewowego na agarze VRBG (Violet Red Bile Glucose) z nakładką, inkubacja 37°C przez 24 h.
Przegląd
Enterobacteriaceae to duża rodzina bakterii Gram-ujemnych obejmująca wiele rodzajów o znaczeniu sanitarnym i chorobotwórczym — Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Serratia, Cronobacter i inne. Są one uznanym wskaźnikiem ogólnego stanu higieny produkcji żywności, uzupełniającym oznaczenie E. coli (wskaźnik zanieczyszczenia kałowego).
Norma PN-EN ISO 21528-2 opisuje horyzontalną metodę oznaczania liczby Enterobacteriaceae w żywności i próbkach środowiskowych. Metoda wykorzystuje podłoże VRBG (Violet Red Bile Glucose Agar) — selektywno-różnicujące podłoże, w którym fiolet krystaliczny i sole żółciowe hamują wzrost bakterii Gram-dodatnich i innych organizmów niebędących Enterobacteriaceae. Glukoza zastępuje laktozę (stosowaną w VRBL), dzięki czemu podłoże wykrywa wszystkich członków Enterobacteriaceae, nie tylko bakterie grupy coli.
Kolonie Enterobacteriaceae na VRBG są czerwone do ciemnopurpurowych, otoczone strefą precypitacji soli żółciowych. Metoda posiewu zalewowego z dodatkową warstwą nakładkową agaru zapewnia warunki zbliżone do anaerobowych, co hamuje wzrost bakterii niefermentujących Gram-ujemnych i promuje fermentację glukozy.
Metoda jest stosowana jako wskaźnik higieny w Rozporządzeniu (WE) nr 2073/2005, m.in. dla mleka w proszku, żywności dla niemowląt i produktów gotowych do spożycia. Jest szczególnie istotna w mleczarstwie, gdzie Enterobacteriaceae wskazują na potencjalne wtórne skażenie po pasteryzacji.
Zasada metody
Próbkę posiewamy zalewowo na podłoże VRBG. Sole żółciowe i fiolet krystaliczny hamują bakterie Gram-dodatnie. Enterobacteriaceae fermentują glukozę do kwasów, które w reakcji z czerwienią obojętną (Neutral Red) barwią kolonie na czerwono-purpurowo. Kwas powoduje także precypitację soli żółciowych wokół kolonii (halo). Po zalaniu, nakłada się dodatkową warstwę agaru VRBG (overlay), która ogranicza dostęp tlenu i hamuje wzrost bakterii tlenowych niefermentujących. Inkubacja w 37°C przez 24 h.
Zastosowania
- Wskaźnik higieny produkcji żywności — Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005
- Kontrola jakości mleka w proszku i preparatów dla niemowląt
- Monitoring wtórnego skażenia po pasteryzacji (post-pasteurization contamination)
- Badanie produktów gotowych do spożycia (RTE)
- Kontrola jakości mięsa i przetworów mięsnych
- Monitoring środowiskowy zakładów produkcyjnych (powierzchnie, woda)
- Weryfikacja skuteczności mycia i dezynfekcji linii produkcyjnych
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Temperatura inkubacji | 37 ± 1°C |
| Czas inkubacji | 24 ± 2 h |
| Podłoże | VRBG Agar (Violet Red Bile Glucose Agar) |
| Typ kolonii | Czerwone do ciemnopurpurowych, z halo precypitacji soli żółciowych |
| Metoda posiewu | Zalewowy (pour plate) z nakładką (overlay) |
| Potwierdzenie | Test oksydazy (ujemny) + test fermentacji glukozy (dodatni) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 21528-2:2017
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobacteriaceae — Część 2: Metoda liczenia kolonii
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie próbki
Odważ 10 g próbki do woreczka stomachera, dodaj 90 mL BPW, homogenizuj 60–120 s. Przygotuj rozcieńczenia dziesiętne.
2. Posiew zalewowy
Przenieś po 1 mL każdego rozcieńczenia na dwie sterylne płytki Petriego. W ciągu 15 min zalej ok. 10 mL podłoża VRBG schłodzonego do 44–47°C. Wymieszaj delikatnie ruchami kolistymi. Pozostaw do zestalenia.
3. Nakładka (overlay)
Po zestaleniu agaru nałóż dodatkową warstwę ok. 10 mL podłoża VRBG (44–47°C) na powierzchnię. Pozostaw do zestalenia. Nakładka ogranicza dostęp tlenu.
4. Inkubacja
Odwróć płytki i inkubuj w 37 ± 1°C przez 24 ± 2 h.
5. Odczyt kolonii
Policz typowe kolonie — czerwone do ciemnopurpurowych, średnicy 0,5 mm lub większe, z halo precypitacji lub bez. Zliczaj płytki z 15–300 koloniami łącznie.
6. Potwierdzenie (opcjonalnie)
Wybierz min. 5 typowych kolonii. Wykonaj test oksydazy (wynik ujemny = Enterobacteriaceae). Zaszczep na bulion glukozowy z rurką Durhama — inkubuj 24 h w 37°C (wynik: fermentacja glukozy + gaz).
7. Obliczenia
Oblicz liczbę Enterobacteriaceae jako średnią ważoną. Jeśli wykonano potwierdzenie, uwzględnij odsetek potwierdzonych kolonii. Wynik wyraź w jtk/g.
8. Kontrola jakości
Kontrola pozytywna: E. coli ATCC 25922 (kolonie typowe, oksydaza-ujemne). Kontrola negatywna: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (brak wzrostu lub kolonie atypowe, oksydaza-dodatnia). Kontrola jałowości podłoża.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator laboratoryjny 37°C | Binder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5 000–18 000 PLN |
| Łaźnia wodna 44–47°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12, POL-EKO LW-4 | 3 000–10 000 PLN |
| Komora laminarna klasy II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream | 25 000–60 000 PLN |
| Stomacher / homogenizator | Seward Stomacher 400, Interscience BagMixer | 12 000–25 000 PLN |
| Autoklaw laboratoryjny | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
| Licznik kolonii | Interscience Scan 300, Stuart SC6+ | 3 000–15 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| VRBG Agar (Violet Red Bile Glucose Agar) | 548-62-9 | Podłoże selektywno-różnicujące: pepton żelatynowy, ekstrakt drożdżowy, sole żółciowe, glukoza, fiolet krystaliczny, czerwień obojętna, NaCl, agar; op. 500 g |
| Fiolet krystaliczny (Crystal Violet) | 548-62-9 | Barwnik hamujący bakterie Gram-dodatnie; stężenie 0,002 g/L |
| Sole żółciowe (Bile Salts Mixture) | — | Czynnik selektywny hamujący bakterie Gram-dodatnie i niefermentujące; 1,5 g/L |
| Czerwień obojętna (Neutral Red) | 553-24-2 | Wskaźnik pH — barwi kolonie fermentujące glukozę na czerwono; 0,03 g/L |
| D-Glukoza | 50-99-7 | Źródło węgla fermentowane przez Enterobacteriaceae; 10 g/L |
| Bulion glukozowy (Glucose Broth) | — | Do testu fermentacji glukozy (potwierdzenie), z rurką Durhama |
| Odczynnik oksydazowy (Kovácsa) | — | Do testu oksydazy — Enterobacteriaceae oksydazo-ujemne; paski lub krople |
| Woda peptonowa buforowana (BPW) | — | Do rozcieńczeń próbki, op. 500 g |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Rodzina Enterobacteriaceae obejmuje patogeny (Salmonella, E. coli) — stosować ŚOI
- Praca w komorze laminarnej klasy II obowiązkowa
- Fiolet krystaliczny — barwi skórę, stosować rękawice
- Zużyte materiały autoklawować przed utylizacją (121°C/20 min)
- Dezynfekcja powierzchni 70% etanolem lub podchlorynem sodu