🦠 E. coli β-glukuronidazo-dodatnie w żywności
Oznaczanie liczby Escherichia coli β-glukuronidazo-dodatnich w żywności metodą posiewu zalewowego na agarze TBX w temperaturze 44°C. Kolonie E. coli tworzą charakterystyczne niebiesko-zielone zabarwienie.
Przegląd
Escherichia coli jest najważniejszym wskaźnikiem zanieczyszczenia kałowego żywności. Obecność E. coli w produkcie spożywczym świadczy o niedostatecznej higienie produkcji, niewłaściwej obróbce termicznej lub wtórnym skażeniu po pasteryzacji. Norma PN-EN ISO 16649-2 określa horyzontalną metodę oznaczania liczby E. coli β-glukuronidazo-dodatnich, wykorzystującą zdolność tych bakterii do rozkładu substratu chromogennego X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-glukuronidu).
Metoda opiera się na posiewie zalewowym (pour plate) na podłożu TBX (Tryptone Bile X-glucuronide Agar) i inkubacji w temperaturze 44°C przez 18–24 h. W tych warunkach E. coli tworzą charakterystyczne niebiesko-zielone kolonie dzięki aktywności enzymu β-glukuronidazy, który hydrolizuje chromogenny substrat. Około 96–97% szczepów E. coli wykazuje aktywność β-glukuronidazy, co czyni metodę wysoce swoistą.
Istotnym ograniczeniem metody jest fakt, że szczepy E. coli O157:H7 — jedne z najgroźniejszych patogenów pokarmowych — są przeważnie β-glukuronidazo-ujemne i nie są wykrywane tą metodą. Dlatego do wykrywania STEC/VTEC stosuje się odrębne metody (np. PN-EN ISO 13136). Metoda nie jest również odpowiednia dla wszystkich szczepów E. coli, które mogą słabo rosnąć w temperaturze 44°C.
Badanie jest wymagane przez polskie i unijne przepisy bezpieczeństwa żywności, w tym Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dla środków spożywczych. Znajduje zastosowanie w kontroli jakości produktów mlecznych, mięsnych, warzyw, owoców morza oraz wody pitnej.
Zasada metody
Metoda wykorzystuje zdolność E. coli do produkcji enzymu β-glukuronidazy (GUD), który hydrolizuje substrat chromogenny 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-glukuronid (X-Gluc) zawarty w podłożu TBX. Hydroliza uwalnia indoksyl, który ulega utlenieniu i dimeryzacji, tworząc nierozpuszczalny niebieski barwnik (5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indygo). Kolonie E. coli przybierają charakterystyczne niebiesko-zielone zabarwienie. Sole żółciowe obecne w podłożu hamują wzrost bakterii Gram-dodatnich, zapewniając selektywność. Inkubacja w 44°C dodatkowo ogranicza wzrost organizmów niebędących E. coli.
Zastosowania
- Kontrola jakości mikrobiologicznej żywności (mięso, nabiał, warzywa, owoce morza)
- Spełnienie wymagań Rozporządzenia (WE) nr 2073/2005 — kryteria mikrobiologiczne
- Monitoring higieny procesów produkcyjnych w zakładach spożywczych
- Badanie wody pitnej i wody używanej w produkcji żywności
- Kontrola skuteczności pasteryzacji i obróbki termicznej
- Weryfikacja systemów HACCP i GHP/GMP
- Badania urzędowe Inspekcji Sanitarnej i Inspekcji Weterynaryjnej
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Temperatura inkubacji | 44 ± 1°C |
| Czas inkubacji | 18–24 h |
| Podłoże | TBX Agar (Tryptone Bile X-glucuronide) |
| Zakres oznaczalności | 10–3 × 10⁵ jtk/g (przy rozcieńczeniach 10⁻¹ do 10⁻⁴) |
| Typ kolonii | Niebiesko-zielone kolonie (β-glukuronidaza +) |
| Metoda posiewu | Zalewowa (pour plate), 1 mL na płytkę |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 16649-2:2004
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby β-glukuronidazo-dodatnich Escherichia coli — Część 2: Metoda liczenia kolonii w temperaturze 44°C z zastosowaniem 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-glukuronidu
- Title (EN)
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli — Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie próbki
Odważ 25 g (lub 10 g) próbki do woreczka stomachera. Dodaj 225 mL (lub 90 mL) wody peptonowej buforowanej (BPW). Homogenizuj w stomacherze przez 60–120 s. Uzyskujesz rozcieńczenie 10⁻¹.
2. Przygotowanie rozcieńczeń
Przygotuj serię rozcieńczeń dziesiętnych (10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴) przenosząc 1 mL do 9 mL rozcieńczalnika. Użyj nowej pipety do każdego rozcieńczenia.
3. Posiew zalewowy
Przenieś po 1 mL każdego rozcieńczenia na dwie sterylne płytki Petriego (duplikaty). W ciągu 15 min zalej ok. 15 mL podłoża TBX schłodzonego do 44–47°C.
4. Mieszanie i zestalanie
Delikatnie wymieszaj inokulum z podłożem ruchami kolistymi i wahliwymi. Pozostaw płytki na poziomej powierzchni do zestalenia agaru (ok. 10–15 min).
5. Resuscytacja (opcjonalnie)
Jeśli podejrzewasz uszkodzone komórki (np. mrożonki), inkubuj płytki 4 h w 37°C przed przeniesieniem do 44°C, aby umożliwić resuscytację.
6. Inkubacja
Odwróć płytki dnem do góry i inkubuj w 44 ± 1°C przez 18–24 h.
7. Odczyt wyników
Policz niebiesko-zielone kolonie typowe dla E. coli β-glukuronidazo-dodatnich. Zliczaj płytki zawierające 15–300 kolonii łącznie (typowe i nietypowe).
8. Obliczenia
Oblicz liczbę E. coli jako średnią ważoną z dwóch kolejnych rozcieńczeń wg wzoru: N = ΣC / (V × 1,1 × d), gdzie ΣC — suma kolonii, V — objętość posiewu, d — rozcieńczenie. Wynik wyraź w jtk/g lub jtk/mL.
9. Kontrola jakości
Równolegle wykonaj kontrolę negatywną (podłoże bez posiewu) i kontrolę pozytywną (szczep referencyjny E. coli ATCC 25922). Sprawdź jałowość wody peptonowej.
10. Dokumentacja i raportowanie
Zapisz wyniki w dzienniku laboratoryjnym, dołącz identyfikację próbki, numery partii podłoży, temperaturę inkubacji i obliczenia. Wynik raportuj jako jtk/g z podaniem niepewności pomiaru.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator laboratoryjny 44°C | Binder BD 56/115, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5 000–18 000 PLN |
| Łaźnia wodna 44–47°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12, POL-EKO LW-4 | 3 000–10 000 PLN |
| Komora laminarna klasy II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream | 25 000–60 000 PLN |
| Autoklaw laboratoryjny | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65, SMS Prestige Medical | 15 000–45 000 PLN |
| Stomacher / homogenizator | Seward Stomacher 400 Circulator, BagMixer 400 | 12 000–25 000 PLN |
| Licznik kolonii | Interscience Scan 300, BZG Colony Star, Stuart SC6+ | 3 000–15 000 PLN |
| Pipety automatyczne 1 mL | Eppendorf Research Plus, Gilson Pipetman, HTL Discovery Comfort | 400–1 200 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| TBX Agar (Tryptone Bile X-glucuronide Agar) | 114162-64-0 | Podłoże chromogenne zawierające trypton, sole żółciowe i X-Gluc; gotowe odważki lub płytki, op. 500 g / 20 płytek |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-glukuronid (X-Gluc) | 114162-64-0 | Substrat chromogenny dla β-glukuronidazy, składnik TBX, op. 1–5 g |
| Tryptone (pepton kazeinowy) | 91079-40-2 | Źródło azotu i aminokwasów w podłożu TBX |
| Sole żółciowe (Bile Salts No. 3) | — | Czynnik selektywny hamujący bakterie Gram-dodatnie, stężenie 1,5 g/L |
| Woda peptonowa buforowana (BPW) | — | Do przygotowania rozcieńczeń dziesiętnych próbki, op. 500 g |
| Agar bakteriologiczny | 9002-18-0 | Czynnik żelujący, op. 500 g |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Praca z materiałem potencjalnie zakaźnym — stosować rękawice jednorazowe, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne
- Wszystkie czynności z otwartą próbką wykonywać w komorze laminarnej klasy II
- Zużyte podłoża i próbki autoklawować (121°C, 15 min) przed utylizacją
- Powierzchnie robocze dezynfekować 70% etanolem lub preparatem na bazie chloru
- Przestrzegać zasad aseptyki — ryzyko zakażenia E. coli enteropatogennymi