🦠 E. coli w wodach powierzchniowych i ściekach — zminiaturyzowana metoda NPL na płytkach mikrotitracyjnych (MUG)

Mikrobiologia PN-EN ISO 9308-3

Przegląd

ISO 9308-3:1998 określa zminiaturyzowaną metodę wykrywania i oznaczania ilościowego Escherichia coli w wodach powierzchniowych i ściekach przez inokulację podłoża płynnego; stosuje się ją do wszystkich rodzajów wód powierzchniowych i ścieków, zwłaszcza bogatych w zawiesinę. Nie nadaje się do wody do spożycia ani innych wód, dla których wartość wytyczna jest niższa niż 15 bakterii/100 ml, i nie służy do wykrywania bakterii grupy coli innych niż E. coli. E. coli definiuje się jako mikroorganizm β-D-glukuronidazo-dodatni rosnący w 44 °C w podłożu płynnym z 4-metyloumbeliferylo-β-D-glukuronidem (MUG). Metoda została zwalidowana w badaniach międzylaboratoryjnych (załącznik D). W Unii Europejskiej dyrektywa 2006/7/WE dotycząca zarządzania jakością wody w kąpieliskach wskazuje ISO 9308-3 lub ISO 9308-1 jako metody referencyjne oznaczania E. coli (jtk/100 ml) w wodach wewnętrznych oraz przybrzeżnych i przejściowych. W Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 9308-3:2002.

Zasada metody

Rozcieńczoną próbkę inokuluje się do rzędu studzienek płytki mikrotitracyjnej zawierających odwodnione podłoże hodowlane. Po inkubacji co najmniej 36 h i najwyżej 72 h w (44 ± 0,5) °C płytki ogląda się w ciemności w świetle UV 366 nm — obecność E. coli wskazuje niebieska fluorescencja powstała z hydrolizy MUG; wynik podaje się jako najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL) na 100 ml. Podłoże MUG/EC zawiera tryptozę 40 g, salicynę 1 g, Triton X-100 1 g i MUG 100 mg na 1000 ml (MUG rozpuszczony w 2 ml N,N-dimetyloformamidu), pH 6,9 ± 0,2, sterylizowane przez filtrację 0,2 µm, rozlewane po 100 µl do studzienek płytek 96-dołkowych (pojemność ≥ 350 µl) i natychmiast odwadniane w suszarce tunelowej lub komorze laminarnej; jego wytwarzanie musi spełniać kryteria jakości załącznika E. Specjalny rozcieńczalnik (SD) to 22,5 g syntetycznej soli morskiej na 1000 ml wody (opcjonalnie z błękitem bromofenolowym dla odróżnienia od wody), sterylizowany 15–20 min w (121 ± 3) °C; dla wody morskiej (zasolenie > 30 g/kg) pierwsze rozcieńczenie robi się w wodzie demineralizowanej. Liczba rozcieńczeń i studzienek zależy od spodziewanego zanieczyszczenia: woda w kąpieliskach — 2 rozcieńczenia (64 studzienki 1/2 i 32 studzienki 1/20; zakres 15–3,5·10⁴/100 ml), świeże wody powierzchniowe — 4 rozcieńczenia po 24 studzienki (40–3,2·10⁶), ścieki i oczyszczalnie — 6 rozcieńczeń po 16 studzienek (60–6,7·10⁸). Z liczby dodatnich studzienek w każdym rozcieńczeniu tworzy się liczbę charakterystyczną, a NPL i 95 % przedział ufności oblicza program z załącznika A lub B (rozkład Poissona); przy braku dodatnich studzienek wynik podaje się jako „< n/100 ml”.

Zastosowania

• Monitoring jakości wody w kąpieliskach — metoda referencyjna E. coli wg dyrektywy 2006/7/WE (wody wewnętrzne, przybrzeżne i przejściowe)
• Wody powierzchniowe (rzeki, jeziora) bogate w zawiesinę, gdzie filtracja membranowa jest nieprzydatna
• Ścieki surowe i oczyszczone, odpływy z oczyszczalni (zakres do 6,7·10⁸/100 ml)
• Wody morskie i słonawe — dzięki rozcieńczalnikowi z solą morską
• Badania duże seryjne — format płytek 96-dołkowych i pipety wielokanałowe

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 9308-3:2002 (ISO 9308-3:1998 + Cor 1:2000)

Tytuł (PL)

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 3: Zminiaturyzowana metoda wykrywania i oznaczania E. coli w wodach powierzchniowych i w ściekach (najbardziej prawdopodobna liczba bakterii)

Title (EN)

Water quality — Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria in surface and waste water — Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid medium

Procedura krok po kroku

1. Pobór próbek

   Pobierz i dostarcz próbki wg ISO 8199 oraz ISO 5667-1, -2 i -3.

2. Wybór rozcieńczeń

   Dobierz liczbę rozcieńczeń i studzienek do spodziewanego zanieczyszczenia (tabela 1 normy): kąpieliska — 64 studzienki 1/2 i 32 studzienki 1/20; wody powierzchniowe — 4 rozcieńczenia po 24 studzienki; ścieki — do 6 rozcieńczeń po 16 studzienek.

3. Rozcieńczenia

   Do probówek dodaj po 9 ml rozcieńczalnika SD (dla wody morskiej o zasoleniu > 30 g/kg — pierwsza probówka z 9 ml wody demineralizowanej). Energicznie wymieszaj próbkę i przenieś 9 ml do pierwszej probówki (1/2), następnie 1 ml do kolejnej (1/20), dalej po 1 ml (1/200 itd.), zmieniając pipety. Pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego (aerozole).

4. Inokulacja płytek

   Zawartość probówki przelej do jałowej płytki Petriego 90 mm i pipetą 8-kanałową rozdaj po 200 µl do studzienek odpowiadających danemu rozcieńczeniu; dla kolejnych rozcieńczeń zmieniaj płytkę Petriego i końcówki. Uważaj na przelewanie między studzienkami.

5. Inkubacja

   Zaklej płytkę jałową folią samoprzylepną i inkubuj w (44 ± 0,5) °C przez 36–72 h, nie przechylając płytek.

6. Odczyt

   Płytkę z folią umieść w komorze UV; za dodatnie uznaj wszystkie studzienki z niebieską fluorescencją (odczyt możliwy w dowolnym czasie po 36 h).

7. Obliczenia

   Dla każdego rozcieńczenia zapisz liczbę dodatnich studzienek jako liczbę charakterystyczną (przy ≥ 3 rozcieńczeniach — trzycyfrową, ostatnia w miarę możliwości 0, wg ISO 8199); oblicz NPL na ml i 95 % przedział ufności programem z załącznika A lub B i przelicz na 100 ml (np. 32/5 → 756/100 ml, 542–1054); bez dodatnich studzienek podaj „< n/100 ml”.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• N,N-dimetyloformamid jest toksyczny i może powodować raka; szkodliwy przez wdychanie, skórę i po połknięciu — praca pod wyciągiem chemicznym
• Promieniowanie UV drażni oczy i skórę — okulary i rękawice ochronne przy odczycie
• Rozcieńczanie i pipetowanie ścieków wytwarza aerozole — komora bezpieczeństwa biologicznego

Najczęstsze pytania