🦠 E. coli i bakterie grupy coli w wodzie
Oznaczanie ilościowe E. coli i bakterii grupy coli w wodzie metodą filtracji membranowej na podłożu chromogennym CCA. Podstawowy wskaźnik zanieczyszczenia kałowego wody pitnej.
Przegląd
Escherichia coli jest najważniejszym wskaźnikiem zanieczyszczenia kałowego wody. Obecność E. coli w wodzie pitnej świadczy o skażeniu odchodami ludzkimi lub zwierzęcymi i potencjalnym zagrożeniu chorobotwórczymi bakteriami, wirusami i pierwotniakami jelitowymi. Bakterie grupy coli (coliformy) obejmują szerszą grupę — oprócz E. coli także Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter — i służą jako ogólny wskaźnik higieny procesu uzdatniania.
Metoda według PN-EN ISO 9308-1 opiera się na filtracji membranowej próbki wody przez sączek o porowatości 0,45 µm, który zatrzymuje bakterie. Sączek umieszcza się na selektywnym podłożu chromogennym CCA (Chromogenic Coliform Agar), zawierającym substraty enzymatyczne: Salmon-GAL (6-chloro-3-indoksylo-β-D-galaktopiranozyd) dla β-galaktozydazy koliformów oraz X-Glukuronid (5-bromo-4-chloro-3-indoksylo-β-D-glukuronid) dla β-glukuronidazy E. coli.
Po inkubacji w 36±2°C przez 18–24 godzin kolonie koliformów wybarwiają się na kolor różowy do czerwonego (aktywność β-galaktozydazy), a kolonie E. coli na kolor ciemnoniebiesko-fioletowy (aktywność obu enzymów). Wynik odczytuje się bezpośrednio — bez konieczności potwierdzania biochemicznego, co znacznie przyspiesza analizę.
Metoda jest przeznaczona dla wód o małej florze towarzyszącej — wody pitnej, wody uzdatnionej, wody podziemnej. Dla wód powierzchniowych i ścieków (duża flora tła) stosuje się PN-EN ISO 9308-2 (metoda NPL z podłożem Colilert).
Zasada metody
Próbkę wody filtruje się przez membranę o porowatości 0,45 µm (średnica 47 mm), która zatrzymuje bakterie. Membranę przenosi się na powierzchnię podłoża chromogennego CCA. Podłoże zawiera dwa substraty chromogenne: Salmon-GAL rozszczepiany przez β-galaktozydazę (enzym koliformów) dając produkt o barwie łososiowo-różowej, oraz X-Glukuronid rozszczepiany przez β-glukuronidazę (enzym specyficzny dla E. coli) dając produkt ciemnoniebieski. Selektywność podłoża zapewnia Tergitol-7, który hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich i większości niekoliformów.
Zastosowania
- Kontrola jakości wody pitnej (Dz.U. 2017 — E. coli: 0 jtk/100 mL)
- Monitoring sieci wodociągowej — punkty poboru u konsumentów
- Badanie wód podziemnych i ujęć wodnych
- Kontrola wody po uzdatnianiu i dezynfekcji
- Badanie wody butelkowanej i źródlanej
- Monitoring wody w budynkach użyteczności publicznej (szpitale, szkoły)
- Woda do celów produkcyjnych w przemyśle spożywczym
- Badania poawaryjne — po awariach sieci wodociągowej
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Wynik | jtk/100 mL (jednostki tworzące kolonie) |
| Dopuszczalna wartość (woda pitna) | E. coli: 0 jtk/100 mL; Coliformy: 0 jtk/100 mL |
| Temperatura inkubacji | 36 ± 2°C |
| Czas inkubacji | 18–24 godziny |
| Objętość próbki | 100 mL (standardowo) lub 250 mL |
| Zakres liniowy | 10–100 kolonii na sączku (optymalne) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 9308-1:2014+A1:2017
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 1: Metoda filtracji membranowej do wód o małej ilości flory towarzyszącej
- Title (EN)
- Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie stanowiska
Wysterylizuj system filtracyjny (autoklaw 121°C/15 min lub płomień). Przygotuj płytki z podłożem CCA — wyjmij z lodówki 30 min wcześniej.
2. Neutralizacja chloru
Jeśli próbka zawiera chlor (woda sieciowa), dodaj tiosiarczan sodu (buforek 1,8% — 0,1 mL na 100 mL próbki). Wymieszaj delikatnie.
3. Filtracja membranowa
Umieść sterylny sączek 0,45 µm na lejku filtracyjnym. Nalej 100 mL próbki. Włącz pompę próżniową. Po przefiltrowaniu przepłucz lejek 20 mL sterylnej wody peptonowej.
4. Przeniesienie sączka na podłoże
Sterylną pęsetą przenieś sączek na płytkę CCA. Upewnij się, że sączek przylega równomiernie, bez pęcherzyków powietrza pod spodem.
5. Inkubacja
Inkubuj płytki odwrócone (dnem do góry) w inkubatorze 36±2°C przez 18–24 godziny. Nie przekraczaj 24 godzin.
6. Odczyt wyników — koliformy
Policz kolonie różowe do czerwone (β-galaktozydazo-dodatnie) = bakterie grupy coli. Optymalna liczba: 10–100 kolonii na sączku.
7. Odczyt wyników — E. coli
Policz kolonie ciemnoniebieskie do fioletowych (β-galaktozydazo- i β-glukuronidazo-dodatnie) = E. coli. E. coli wchodzi w skład ogólnej liczby koliformów.
8. Test oksydazowy (potwierdzenie)
Przenieś podejrzane kolonie na pasek oksydazowy. E. coli jest oksydazo-ujemna (brak zmiany barwy). Kolonie oksydazo-dodatnie odrzuć.
9. Obliczenie wyniku
Wynik = liczba potwierdzonych kolonii na 100 mL próbki. Dla wody pitnej wymagany wynik: 0 jtk/100 mL zarówno dla E. coli, jak i koliformów.
10. Kontrola jakości
Codziennie: kontrola negatywna (sterylna woda), kontrola pozytywna (szczep E. coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 13048). Sprawdź sterylność podłoża.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| System filtracji membranowej | Sartorius Combisart, Merck EZ-Fit, Pall MicroFunnel | 3 000–12 000 PLN |
| Pompa próżniowa / ssąca | KNF Laboport N 810, Sartorius 16612 | 3 000–8 000 PLN |
| Inkubator bakteriologiczny 36°C | Binder BD 56, Memmert IN30, Pol-Eko CLN 32 | 5 000–15 000 PLN |
| Autoklaw do sterylizacji | Tuttnauer ELV 2540, Systec VX-40 | 20 000–45 000 PLN |
| Lampa UV / palnik Bunsena | Lampa bakteriobójcza UVC do komory, palnik Teclu | 200–1 500 PLN |
| Komora laminarna (opcjonalnie) | Esco Airstream, Telstar Bio II Advance | 15 000–40 000 PLN |
| Lupa / licznik kolonii | Stuart SC6+, Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Chromogenic Coliform Agar (CCA) | — | Podłoże chromogenne wg ISO 9308-1, zawiera Salmon-GAL + X-Glukuronid + Tergitol-7. Producenci: Merck, Biokar, Oxoid |
| Sączki membranowe 0,45 µm | — | Celulozowe mieszane (MCE), średnica 47 mm, sterylne, z siatką. Merck Millipore, Sartorius, Pall |
| Tiosiarczan sodu (Na₂S₂O₃) | 7772-98-7 | Buforki do neutralizacji chloru w próbkach, 18 mg/L na 500 mL próbki |
| Roztwór Ringera (1/4 stężenia) | — | Do rozcieńczania próbek, sterylny, buforki po 9 mL |
| Woda peptonowa buforowana | — | Alternatywa do rozcieńczeń, 0,1% pepton + 0,85% NaCl, pH 7,0 |
| Odczynnik oksydazowy (Kovacsa) | 2436-85-3 | Paski oksydazowe do potwierdzenia E. coli (oksydazo-ujemna). Tetramethyl-p-phenylenediamine |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Próbki wody mogą zawierać patogeny — pracować w rękawicach nitrylowych i fartuchu laboratoryjnym
- Podłoża z koloniami po inkubacji traktować jako materiał zakaźny — autoklaw przed utylizacją
- Praca przy palniku Bunsena — ryzyko oparzenia, nie zostawiać bez nadzoru
- Tiosiarczan sodu — niskie ryzyko, unikać kontaktu z oczami
- Lampa UV — nie patrzeć bezpośrednio w źródło promieniowania, ryzyko uszkodzenia wzroku