🦠 E. coli i bakterie grupy coli w wodzie — metoda NPL z podłożem enzymatycznym (Colilert-18 / Quanti-Tray)

Mikrobiologia PN-EN ISO 9308-2

Przegląd

Obecność i skala zanieczyszczenia kałowego to ważny czynnik oceny jakości wody i ryzyka zakażenia; badanie na obecność Escherichia coli, bytującej w jelitach ludzi i zwierząt stałocieplnych, wskazuje na takie zanieczyszczenie. Wynik dla bakterii grupy coli trudniej interpretować, bo część z nich żyje w glebie i wodach powierzchniowych — ich obecność nie dowodzi zanieczyszczenia kałowego, ale może wskazywać na niesprawność uzdatniania lub wniknięcie wody do sieci. ISO 9308-2:2012 (drugie wydanie, zastępujące ISO 9308-2:1990) określa metodę oznaczania ilościowego E. coli i bakterii grupy coli w wodzie opartą na wzroście w podłożu płynnym i obliczeniu najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) z tablic. Stosuje się ją do wszystkich rodzajów wody, także z dużą ilością zawiesiny i wysokim tłem bakterii heterotroficznych; nie wolno jej używać do oznaczania bakterii grupy coli w wodzie morskiej, a do E. coli w wodzie morskiej zwykle wymagane jest rozcieńczenie 1→10 w jałowej wodzie. Wykrywanie E. coli opiera się na ekspresji β-D-glukuronidazy, więc metoda nie wykrywa wielu szczepów enterokrwotocznych (np. O157), które tego enzymu zwykle nie wytwarzają — pojawiają się one jako bakterie grupy coli. Wynik jest potwierdzony bez dalszego potwierdzania dodatnich studzienek. ISO zwraca uwagę, że stosowanie normy może wiązać się z patentami IDEXX (Colilert-18, Quanti-Tray). W Polsce rozporządzenie Ministra Zdrowia z 7 grudnia 2017 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi (Dz.U. 2017 poz. 2294) wymienia PN-EN ISO 9308-1 i PN-EN ISO 9308-2 jako zalecane normy badania E. coli i bakterii grupy coli.

Zasada metody

Do próbki wody (100 ml) lub rozcieńczenia uzupełnionego do 100 ml dodaje się jednorazowe opakowanie (snap pack) odwodnionego podłoża Colilert-18 (2,8 g), miesza do rozpuszczenia i aseptycznie rozlewa do tacki Quanti-Tray (do 201 organizmów/100 ml, 51 studzienek) lub Quanti-Tray/2000 (do 2419 organizmów/100 ml, 97 studzienek); tacki zgrzewa się w zgrzewarce Quanti-Tray i inkubuje w (36 ± 2) °C przez 18–22 h. Studzienki o barwie żółtej równej lub intensywniejszej niż komparator uznaje się za dodatnie dla bakterii grupy coli; żółte studzienki wykazujące jakąkolwiek fluorescencję w UV (365 nm) — za dodatnie dla E. coli. Żółte zabarwienie pochodzi z rozkładu orto-nitrofenylogalaktozydu (ONPG) przez β-D-galaktozydazę, a fluorescencja — z rozkładu 4-metyloumbeliferylo-glukuronidu (MUG) przez β-D-glukuronidazę do fluoryzującego metyloumbeliferonu. Bakteria grupy coli to członek Enterobacteriaceae wytwarzający β-D-galaktozydazę, E. coli — wytwarzający obie te enzymy. NPL na 100 ml odczytuje się z tablic statystycznych lub programu; dla tacki 51-studzienkowej NPL = N·ln[N/(N − X)]. Podłoże można też użyć w klasycznym układzie probówek NPL (np. 1 × 50 ml i 5 × 10 ml) albo jako test obecność/nieobecność w 100 ml — wtedy probówki wstępnie ogrzewa się 20 min w (36 ± 2) °C. Do rozcieńczeń używa się wyłącznie jałowej, nieinhibitującej wody bez utleniaczy (dejonizowanej lub wodociągowej); rozcieńczalniki buforowane, solankowe i peptonowe zakłócają test.

Zastosowania

• Monitoring wody do spożycia (zalecana norma w rozporządzeniu MZ z 2017 r.) i wody w sieciach dystrybucyjnych — szybki wynik po 18 h
• Wody o dużej zawartości zawiesiny i wysokim tle heterotrofów, gdzie filtracja membranowa zawodzi (wody powierzchniowe, surowe, studnie)
• Wody morskie i słonawe — oznaczanie E. coli po rozcieńczeniu 1→10 (bakterie grupy coli w wodzie morskiej wykluczone)
• Test obecność/nieobecność w 100 ml oraz klasyczny układ probówek NPL z tym samym podłożem
• Laboratoria stacji sanitarno-epidemiologicznych i wodociągów — brak potrzeby potwierdzania i liczenia kolonii

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 9308-2:2014-06 (ISO 9308-2:2012)

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 2: Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

Title (EN)

Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 2: Most probable number method

Procedura krok po kroku

1. Pobór i transport

   Pobierz próbki wg ISO 19458, transportuj i przechowuj w (5 ± 3) °C; rozpocznij analizę w dniu poboru lub w ciągu 18 h (wyjątkowo do 24 h).

2. Dodanie podłoża

   Do 100 ml próbki (lub rozcieńczenia; woda morska zwykle 1→10 w jałowej wodzie) aseptycznie dodaj jedno opakowanie Colilert-18 (2,8 g) i delikatnie wstrząsaj do całkowitego rozpuszczenia.

3. Rozlanie i zgrzanie

   Wlej próbkę z podłożem do tacki Quanti-Tray lub Quanti-Tray/2000 i zgrzej w zgrzewarce; alternatywnie rozlej do jałowych probówek w układzie NPL (np. 1 × 50 ml i 5 × 10 ml) lub inkubuj całe 100 ml jako test obecność/nieobecność — wtedy ogrzej wstępnie 20 min w (36 ± 2) °C.

4. Inkubacja

   Inkubuj tacki 18–22 h w (36 ± 2) °C.

5. Odczyt

   Za dodatnie dla bakterii grupy coli uznaj studzienki o barwie żółtej co najmniej takiej jak komparator; obejrzyj tacki pod lampą UV 365 nm w ciemni — żółte studzienki z jakąkolwiek fluorescencją są dodatnie dla E. coli. Przy wątpliwym zabarwieniu po 18 h przedłuż inkubację do 22 h; wyniki dodatnie przed 18 h i ujemne po 22 h są ważne.

6. Obliczenie i sprawozdanie

   Z liczby dodatnich studzienek odczytaj NPL/100 ml dla bakterii grupy coli i E. coli z tablic B.1/B.2 lub programu; wynik „< 1” przy braku dodatnich (przy rozcieńczeniu 1→10 — „< 10”). Podaj metodę, identyfikację próbki, wynik i odstępstwa; stosuj kontrole dodatnie, ujemne i ślepe.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Praca z materiałem potencjalnie zawierającym patogeny jelitowe — zasady dobrej praktyki mikrobiologicznej, dezynfekcja i autoklawowanie zużytych tacek
• Lampa UV 365 nm — ochrona oczu i skóry podczas odczytu
• Zgrzewarka nagrzewa się — nie dotykaj elementów grzejnych

Najczęstsze pytania