🍄 Drożdże i pleśnie w żywności
Oznaczanie liczby drożdży i pleśni w żywności metodą posiewu powierzchniowego na agarze DRBC (produkty o aw > 0,95) lub DG18 (produkty o aw ≤ 0,95) z inkubacją w 25°C przez 5–7 dni.
Przegląd
Drożdże i pleśnie są wszechobecnymi organizmami odpowiedzialnymi za psucie się żywności — powodują zmiany smaku, zapachu, konsystencji i wyglądu produktów spożywczych. Niektóre pleśnie (Aspergillus, Penicillium, Fusarium) wytwarzają mykotoksyny — wtórne metabolity o działaniu kancerogennym, hepatotoksycznym, nefrotoksycznym i immunosupresyjnym (aflatoksyny, ochratoksyna A, deoksyniwalenol, zearalenon).
Norma PN-EN ISO 21527 składa się z dwóch części, dostosowanych do aktywności wodnej (aw) badanego produktu. Część 1 dotyczy produktów o aw > 0,95 (mleko, mięso, jaja, warzywa, owoce, świeże pasty) i wykorzystuje podłoże DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar). Część 2 dotyczy produktów o aw ≤ 0,95 (suszone owoce, ciasta, dżemy, suszone mięso, ryby solone, zboża, mąki, orzechy, przyprawy) i wykorzystuje podłoże DG18 (Dichloran 18% Glycerol Agar).
W obu przypadkach inkubacja odbywa się w 25 ± 1°C przez 5 dni (z możliwością przedłużenia do 7 dni). Dichloran i czerwień bengalska ograniczają rozrost szybko rosnących pleśni i zmniejszają rozmiar kolonii, umożliwiając zliczanie. Chloramfenikol hamuje wzrost bakterii. Glicerol w DG18 obniża aw podłoża, sprzyjając wzrostowi grzybów kseroflinych i osmofilnych.
Metoda jest szeroko stosowana w kontroli jakości żywności, monitoringu środowiskowym zakładów produkcyjnych oraz ocenie trwałości produktów. Nie obejmuje ona oznaczania zarodników pleśni ani identyfikacji gatunkowej grzybów — do tego potrzebne są metody mykologiczne.
Zasada metody
Próbkę posiewamy powierzchniowo na podłoże DRBC (aw > 0,95) lub DG18 (aw ≤ 0,95). Dichloran (2,6-dichloro-4-nitroanilina) ogranicza rozrost szybko rosnących pleśni (np. Rhizopus, Mucor). Czerwień bengalska dodatkowo zmniejsza rozmiar kolonii i ułatwia ich zliczanie. Chloramfenikol hamuje wzrost bakterii. W DG18 glicerol (18%) obniża aktywność wodną podłoża do ok. 0,955, co promuje wzrost drożdży osmofilnych i pleśni kserofilnych. Po inkubacji 5 dni w 25°C liczymy oddzielnie kolonie drożdży (gładkie, wilgotne, wypukłe) i pleśni (puszyste, włókniste, barwne).
Zastosowania
- Kontrola jakości owoców, warzyw i soków owocowych
- Badanie produktów zbożowych — mąka, kasza, płatki, pieczywo
- Monitoring produktów suszonych — orzechy, przyprawy, suszone owoce, herbatki ziołowe
- Kontrola jakości przetworów mlecznych — jogurty, sery, lody
- Badanie dżemów, konfitur, syropów i miodów
- Monitoring środowiskowy zakładów produkcyjnych (wymazówki, sedymentacja)
- Ocena trwałości mikrobiologicznej produktów spożywczych
- Kontrola kosmetyków i suplementów diety
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Temperatura inkubacji | 25 ± 1°C |
| Czas inkubacji | 5 dni (możliwość przedłużenia do 7 dni) |
| Podłoże (aw > 0,95) | DRBC Agar (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol) |
| Podłoże (aw ≤ 0,95) | DG18 Agar (Dichloran 18% Glycerol Agar) |
| Metoda posiewu | Powierzchniowy (spread plate), 0,1 mL na płytkę |
| Zakres zliczania | 10–150 kolonii na płytkę (typowe i atypowe) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 21527-1:2009 / PN-EN ISO 21527-2:2009
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni — Część 1: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej powyżej 0,95 / Część 2: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej ≤ 0,95
- Title (EN)
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0.95 / Part 2: Colony count technique in products with water activity ≤ 0.95
Procedura krok po kroku
1. Określenie aktywności wodnej produktu
Zmierz aw próbki za pomocą miernika aktywności wodnej. Jeśli aw > 0,95 → użyj DRBC. Jeśli aw ≤ 0,95 → użyj DG18.
2. Przygotowanie próbki
Odważ 10 g próbki do woreczka stomachera, dodaj 90 mL wody peptonowej buforowanej, homogenizuj 60–120 s. Przygotuj rozcieńczenia dziesiętne.
3. Przygotowanie podłoża
Rozpuść odpowiednią ilość podłoża (DRBC lub DG18) w wodzie destylowanej. Sterylizuj w autoklawie (121°C/15 min). Schłodź do 47°C. Dodaj chloramfenikol. Rozlej na płytki (18–20 mL). Wysusz powierzchnię.
4. Posiew powierzchniowy
Nałóż 0,1 mL rozcieńczenia na powierzchnię płytki. Rozprowadź szpatułką Drigalskiego. Wykonaj duplikaty. Pozostaw do wchłonięcia inokulum.
5. Inkubacja
Inkubuj płytki w pozycji normalnej (dnem do dołu) w 25 ± 1°C. NIE odwracaj płytek — pleśnie rozrastałyby się na pokrywce.
6. Odczyt po 2–3 dniach (kontrolny)
Sprawdź wzrost po 2–3 dniach. Zaznacz szybko rosnące pleśnie, które mogą utrudnić zliczanie po 5 dniach.
7. Odczyt końcowy po 5 dniach
Policz oddzielnie kolonie drożdży (gładkie, wilgotne, kremowe) i pleśni (puszyste, włókniste, barwne). Zliczaj płytki z 10–150 koloniami. Jeśli po 5 dniach wzrost jest słaby, przedłuż inkubację do 7 dni.
8. Obliczenia
Oblicz liczbę drożdży i pleśni oddzielnie (lub łącznie) jako średnią ważoną z duplikatów. Wynik wyraź w jtk/g.
9. Kontrola jakości
Kontrola pozytywna: Saccharomyces cerevisiae (drożdże) i Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (pleśnie). Kontrola jałowości podłoża.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator laboratoryjny 25°C | Binder BD 56, Memmert IPP 110, POL-EKO ST 2 | 5 000–18 000 PLN |
| Komora laminarna klasy II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream AC2 | 25 000–60 000 PLN |
| Stomacher / homogenizator | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| Łaźnia wodna 44–47°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12 | 3 000–10 000 PLN |
| Miernik aktywności wodnej (aw) | Novasina LabMaster-aw, Rotronic HygroLab C1 | 8 000–25 000 PLN |
| Autoklaw laboratoryjny | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
| Licznik kolonii | Interscience Scan 300, Stuart SC6+ | 3 000–15 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| DRBC Agar (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol) | 99-30-9 | Podłoże do produktów o aw > 0,95; pepton, glukoza, dichloran, czerwień bengalska, chloramfenikol, agar; op. 500 g |
| DG18 Agar (Dichloran 18% Glycerol Agar) | 56-81-5 | Podłoże do produktów o aw ≤ 0,95; pepton, glukoza, dichloran, glicerol 220 g/L, chloramfenikol, agar; op. 500 g |
| Dichloran (2,6-dichloro-4-nitroanilina) | 99-30-9 | Ogranicza rozrost szybko rosnących pleśni, stężenie 2 mg/L |
| Czerwień bengalska (Rose Bengal) | 632-69-9 | Barwnik ograniczający wielkość kolonii pleśni, stężenie 25 mg/L |
| Chloramfenikol | 56-75-7 | Antybiotyk hamujący wzrost bakterii; roztwór 1% w etanolu, stężenie końcowe 100 mg/L |
| Glicerol | 56-81-5 | Składnik DG18 obniżający aktywność wodną podłoża do ~0,955; 220 g/L |
| Woda peptonowa buforowana (BPW) | — | Do rozcieńczeń próbki, op. 500 g |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Niektóre pleśnie wytwarzają mykotoksyny i alergeny — pracować w komorze laminarnej
- Zarodniki pleśni łatwo się unoszą — unikać gwałtownych ruchów przy otwieraniu płytek
- Chloramfenikol — potencjalnie szkodliwy, unikać kontaktu ze skórą i wdychania
- Dichloran — drażniący, stosować rękawice i fartuch
- Zużyte płytki z pleśniami autoklawować przed utylizacją (121°C/20 min)