🦠 Drożdże i pleśnie w produktach o aw > 0,95 — posiew powierzchniowy na agar DRBC, 25 °C, 5 dni

Mikrobiologia PN-ISO 21527-1

Przegląd

ISO 21527-1:2008 określa horyzontalną metodę oznaczania liczby żywych drożdży i pleśni w produktach dla ludzi i zwierząt o aktywności wody wyższej niż 0,95 — jaja, mięso, przetwory mleczne (z wyjątkiem mleka w proszku), owoce, warzywa, świeże pasty itp. — metodą liczenia kolonii w (25 ± 1) °C. Nie pozwala oznaczać zarodników pleśni; identyfikacja grzybów i badanie mikotoksyn leżą poza zakresem; metoda nie nadaje się do grzybów ciepłoopornych (Byssochlamys fulva, B. nivea) w konserwach owocowych i warzywnych. Drożdże definiuje się jako mezofilne tlenowe mikroorganizmy tworzące w 25 °C na podłożu mikologicznym matowe lub błyszczące, okrągłe kolonie o regularnym brzegu i wypukłej powierzchni, a pleśnie — jako mezofilne tlenowe organizmy nitkowate tworzące płaskie lub puszyste, rozpełzające się kolonie, często z barwnymi strukturami zarodnikującymi; rozróżnienie bywa umowne. Norma ostrzega, że liczenie pleśni wymaga szczególnej ostrożności dla ochrony operatora i przed skażeniem powietrza zarodnikami. W Polsce wprowadzono ją jako PN-ISO 21527-1:2009 (zastąpiła PN-ISO 7954:1999); PKN wycofał tę normę 25.09.2020, ale ISO 21527-1:2008 nadal obowiązuje i laboratoria żywności powszechnie oznaczają liczbę drożdży i pleśni „wg PN-ISO 21527-1:2009”. Część 2 (ISO 21527-2) dotyczy produktów o aw ≤ 0,95 i podłoża DG18.

Zasada metody

Przygotowuje się płytki posiane powierzchniowo określoną ilością próbki płynnej, zawiesiny wyjściowej lub rozcieńczeń dziesiętnych na selektywnym podłożu; płytki inkubuje się tlenowo w (25 ± 1) °C przez 5 dni, w razie potrzeby pozostawiając je 1–2 dni w rozproszonym świetle dziennym; liczy się kolonie/propagule, a wątpliwe kolonie (drożdże a bakterie) sprawdza pod lupą binokularną (6,5–50×) lub mikroskopem (250–1000×); liczbę drożdży i pleśni na g lub ml oblicza się z płytek o policzalnej liczbie kolonii, licząc pleśnie i drożdże osobno, jeśli trzeba. Rozcieńczalnik: zalecana 0,1 % woda peptonowa (hydrolizat 1 g/l, pH 7,0 ± 0,2); do rozcieńczalników można dodać 0,05 % Tween 80 dla ograniczenia zbrylania zarodników. Podłoże DRBC (na 1000 ml): hydrolizat tkanek zwierzęcych i roślinnych 5 g, D-glukoza 10 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·H₂O 0,5 g, dichloran (2,6-dichloro-4-nitroanilina) 0,002 g, róż bengalski 0,025 g, agar 12–15 g, chloramfenikol 0,1 g; składniki bez chloramfenikolu gotuje się, pH po sterylizacji 5,6 ± 0,2, dodaje 10 ml 1 % roztworu chloramfenikolu w etanolu, sterylizuje 121 °C 15 min, chłodzi w 44–47 °C i rozlewa po 15 ml na płytki; podłoże chroni się przed światłem (cytotoksyczne produkty rozkładu różu bengalskiego zaniżają wynik). Opcje: chlorotetracyklina 50 mg/l + chloramfenikol 50 mg/l przy przeroście bakterii (np. surowe mięso; gentamycyna niezalecana), pierwiastki śladowe (ZnSO₄, CuSO₄) dla pełnej morfologii pleśni, Tergitol 1 ml/l przeciw przerostowi Mucoraceae. Badanie wykonania podłoża: produktywność 5 dni w 25 °C z Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404, Mucor racemosus ATCC 42647 wobec SDA (PR ≥ 0,5); selektywność — całkowite zahamowanie E. coli ATCC 25922 lub Bacillus subtilis ATCC 6633.

Zastosowania

• Produkty o wysokiej aktywności wody: mięso i wędliny, jaja i produkty jajeczne, jogurty, sery, śmietana, soki i owoce, warzywa, sałatki, świeże pasty
• Ocena trwałości i higieny produkcji żywności chłodzonej; badania reklamacyjne (psucie przez drożdże)
• Pasze wilgotne i surowce
• Kontrola jakości podłoży mikologicznych (badanie wykonania wg ISO/TS 11133)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-ISO 21527-1:2009 (ISO 21527-1:2008); norma PN wycofana przez PKN 25.09.2020 bez wskazania następcy — ISO 21527-1:2008 pozostaje aktualna

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni — Część 1: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wody wyższej niż 0,95

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0,95

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie podłoża

   Zawieś składniki DRBC bez chloramfenikolu, zagotuj, nastaw pH tak, by po sterylizacji wynosiło 5,6 ± 0,2, dodaj 10 ml 1 % chloramfenikolu w etanolu, sterylizuj 121 °C 15 min, ostudź w 44–47 °C i rozlej po 15 ml; wysusz powierzchnię płytek wg ISO 7218 i przechowuj w ciemności.

2. Próbka i rozcieńczenia

   Przygotuj zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesiętne wg ISO 6887 / ISO 8261, zalecany rozcieńczalnik — 0,1 % woda peptonowa (opcjonalnie 0,05 % Tween 80).

3. Posiew powierzchniowy

   Nanieś określoną ilość próbki płynnej, zawiesiny wyjściowej lub rozcieńczeń na powierzchnię płytek DRBC i rozprowadź głaszczką (< 2 mm średnicy, aby zminimalizować ilość próbki na głaszczce).

4. Inkubacja

   Inkubuj tlenowo w (25 ± 1) °C przez 5 dni; w razie potrzeby pozostaw płytki 1–2 dni w rozproszonym świetle dziennym.

5. Liczenie

   Policz kolonie/propagule na płytkach o policzalnej liczbie; wątpliwe kolonie (drożdże vs bakterie) sprawdź pod lupą binokularną lub mikroskopem; w razie potrzeby licz pleśnie i drożdże osobno.

6. Wynik

   Oblicz liczbę drożdży i pleśni na g lub ml z płytek z wybranych rozcieńczeń; podaj dodatki opcjonalne użyte w podłożu i odstępstwa.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Zarodniki pleśni — praca z największą ostrożnością, najlepiej w komorze, aby chronić operatora i nie skazić powietrza laboratorium
• Chloramfenikol i chlorotetracyklina — antybiotyki; unikać pylenia i kontaktu ze skórą; dichloran i róż bengalski — odważanie w rękawicach
• Podłoże wrażliwe na światło — produkty rozkładu są cytotoksyczne

Najczęstsze pytania