🦠 Drożdże osmofilne i pleśnie kserofilne w produktach o aw ≤ 0,95 — posiew powierzchniowy na agar DG18, 25 °C, 5–7 dni

Mikrobiologia PN-ISO 21527-2

Przegląd

ISO 21527-2:2008 określa horyzontalną metodę oznaczania liczby żywych drożdży osmofilnych i pleśni kserofilnych w produktach dla ludzi i zwierząt o aktywności wody niższej lub równej 0,95 (np. owoce suszone, ciasta, dżemy, suszone mięso, mąka i zboża, przyprawy, orzechy, pasze suche); nie pozwala oznaczać zarodników pleśni, a identyfikacja grzybów i badanie mikotoksyn leżą poza zakresem. Metoda nie nadaje się do halofilnych grzybów kserofilnych (Polypaecilum pisce, Basipetospora halophila) występujących np. w suszonych rybach. Drożdże osmofilne i pleśnie kserofilne definiuje się jako grzyby zdolne do wzrostu przy aw ≤ 0,95; pozostałe definicje przejmuje z ISO 21527-1. Próbki laboratoryjnej nie wolno zamrażać. W Polsce norma weszła jako PN-ISO 21527-2:2009; PKN wycofał ją 25.09.2020, ale ISO 21527-2:2008 nadal obowiązuje i laboratoria oznaczają liczbę drożdży i pleśni w produktach suchych „wg PN-ISO 21527-2:2009”. Część 1 dotyczy produktów o aw > 0,95 i podłoża DRBC.

Zasada metody

Przygotowuje się płytki posiane powierzchniowo określoną ilością próbki, zawiesiny wyjściowej lub rozcieńczeń na selektywnym podłożu i inkubuje tlenowo w (25 ± 1) °C przez 5–7 dni (w razie potrzeby 1–2 dni w rozproszonym świetle dziennym); kolonie liczy się, wątpliwe sprawdza pod lupą binokularną lub mikroskopem, a liczbę na g lub ml oblicza z płytek o policzalnej liczbie kolonii, licząc drożdże i pleśnie osobno, jeśli trzeba. Do rozcieńczeń zaleca się rozcieńczalnik z dostateczną ilością substancji rozpuszczonej — 20–35 % roztwór glicerolu lub D-glukozy — aby zminimalizować szok osmotyczny komórek; poza tym 0,1 % woda peptonowa (pH 7,0 ± 0,2), opcjonalnie z 0,05 % Tween 80. Ze względu na szybką sedymentację zarodników pipetę trzyma się poziomo, a zawiesiny wstrząsa; do homogenizacji preferuje się homogenizator perystaltyczny. Podłoże DG18 (na 1000 ml): hydrolizat kazeiny 5 g, D-glukoza 10 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·H₂O 0,5 g, dichloran 0,002 g, glicerol bezwodny 220 g, agar 12–15 g, chloramfenikol 0,1 g; składniki bez chloramfenikolu gotuje się, pH po sterylizacji 5,6 ± 0,2, dodaje 10 ml 1 % chloramfenikolu w etanolu, sterylizuje 121 °C 15 min, chłodzi w 44–47 °C i rozlewa po 15 ml; chronić przed światłem. Opcje: chlorotetracyklina 50 mg/l + chloramfenikol 50 mg/l (gentamycyna niezalecana), pierwiastki śladowe (ZnSO₄·7H₂O 1 g, CuSO₄·5H₂O 0,5 g/100 ml; 1 ml/l). Badanie wykonania: produktywność 5 dni w 25 °C z Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Wallemia sebi ATCC 42694, Aspergillus restrictus ATCC 42693, Eurotium rubrum ATCC 42690 wobec SDA (PR ≥ 0,5); selektywność — całkowite zahamowanie E. coli ATCC 25922 i Bacillus subtilis ATCC 6633.

Zastosowania

• Produkty suche i o obniżonej aktywności wody: owoce suszone, orzechy, zboża i mąka, przyprawy, ciasta, dżemy, suszone mięso i wędliny dojrzewające, mleko w proszku
• Pasze suche i surowce paszowe
• Ocena ryzyka pleśni kserofilnych (Eurotium, Aspergillus restrictus, Wallemia) w magazynowanych surowcach
• Kontrola jakości podłoży mikologicznych o obniżonej aw

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-ISO 21527-2:2009 (ISO 21527-2:2008); norma PN wycofana przez PKN 25.09.2020 bez wskazania następcy — ISO 21527-2:2008 pozostaje aktualna

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni — Część 2: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wody niższej lub równej 0,95

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 2: Colony count technique in products with water activity less than or equal to 0,95

Procedura krok po kroku

1. Podłoże

   Zawieś składniki DG18 bez chloramfenikolu, zagotuj, nastaw pH (po sterylizacji 5,6 ± 0,2), dodaj 10 ml 1 % chloramfenikolu w etanolu, sterylizuj 121 °C 15 min, ostudź w 44–47 °C, rozlej po 15 ml, wysusz powierzchnię i przechowuj w ciemności.

2. Próbka

   Nie zamrażaj próbki laboratoryjnej; przygotuj zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia wg ISO 6887 / ISO 7218 / ISO 8261, najlepiej w rozcieńczalniku z 20–35 % glicerolu lub glukozy (albo 0,1 % wodzie peptonowej), homogenizatorem perystaltycznym.

3. Posiew powierzchniowy

   Wstrząśnij zawiesiny, pipetę trzymaj poziomo; nanieś określoną ilość na powierzchnię płytek DG18 i rozprowadź głaszczką.

4. Inkubacja

   Inkubuj tlenowo w (25 ± 1) °C przez 5–7 dni; w razie potrzeby 1–2 dni w rozproszonym świetle dziennym.

5. Liczenie

   Policz kolonie na płytkach o policzalnej liczbie, wątpliwe sprawdź pod lupą binokularną lub mikroskopem; w razie potrzeby licz drożdże i pleśnie osobno.

6. Wynik

   Oblicz liczbę drożdży i pleśni na g lub ml i podaj użyte dodatki opcjonalne oraz odstępstwa.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Zarodniki pleśni kserofilnych łatwo się rozprzestrzeniają — praca ostrożna, w komorze; ochrona dróg oddechowych przy suchych, pylących próbkach
• Chloramfenikol, chlorotetracyklina, dichloran — unikać pylenia i kontaktu ze skórą
• Podłoże wrażliwe na światło — przechowywać w ciemności

Najczęstsze pytania