🦠 Drożdże i pleśnie w kosmetykach — liczenie kolonii na agarze Sabourauda z chloramfenikolem (25 °C, 3–5 dni)

Mikrobiologia PN-EN ISO 16212

Przegląd

ISO 16212:2017 podaje ogólne wytyczne oznaczania liczby drożdży i pleśni obecnych w kosmetykach przez liczenie kolonii na selektywnym podłożu agarowym po inkubacji tlenowej. Norma zaleca analizę ryzyka mikrobiologicznego dla ustalenia, do jakich produktów ją stosować; produkty niskiego ryzyka (ISO 29621) to te o niskiej aktywności wodnej, hydroalkoholowe, o skrajnym pH itp. Ze względu na różnorodność produktów metoda może nie pasować w każdym szczególe (np. do niektórych produktów niemieszających się z wodą); inne metody (np. automatyczne) dopuszcza się po wykazaniu równoważności. Policzone drożdże można zidentyfikować testami z norm wymienionych w bibliografii, pleśnie — innymi odpowiednimi metodami. Drożdże definiuje norma jako jednokomórkowe grzyby rozmnażające się głównie wegetatywnie przez pączkowanie, pleśnie — jako mikrogrzyby tworzące grzybnię, wraz z zarodnikami i konidiami, zdolne do wzrostu w warunkach badania.

W Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 16212:2017-08 ze zmianą A1:2023-01. Laboratoria badające kosmetyki stosują ją do oznaczania grzybów na agarze SDA równolegle z PN-EN ISO 21149 (bakterie na TSA) w ramach parametru „tlenowe mikroorganizmy mezofilne”.

Zasada metody

Metoda polega na liczeniu kolonii na selektywnym podłożu agarowym; ewentualne hamowanie wzrostu grzybów przez próbkę musi zostać zneutralizowane, a neutralizacja właściwości przeciwgrzybiczych produktu — sprawdzona i wykazana. Liczenie płytkowe: przygotowanie płytek wgłębnych lub powierzchniowych na określonym podłożu i inokulacja określoną ilością zawiesiny wyjściowej lub rozcieńczenia; inkubacja tlenowa w (25 ± 2,5) °C przez 3–5 dni; policzenie jtk i obliczenie liczby drożdży i pleśni na mililitr lub gram produktu. Filtracja membranowa: odpowiednią ilość przygotowanej próbki przenosi się do aparatu filtracyjnego zwilżonego jałowym rozcieńczalnikiem, natychmiast filtruje i przemywa, filtr przenosi na powierzchnię podłoża (wg ISO 21148) i inkubuje jak wyżej. Warunkiem alternatywnym jest (22,5 ± 2,5) °C przez 5–7 dni na podłożu bez antybiotyku. Podłoża: rozcieńczalnik neutralizujący SCDLP 20 (kazeina trawiona trzustkowo 20,0 g, lecytyna sojowa 5,0 g, polisorbat 20 40 ml, woda 960 ml; polisorbat rozpuszcza się w łaźni (49 ± 2) °C, po dodaniu składników ogrzewa ok. 30 min; sterylizacja 121 °C, 15 min; pH 7,3 ± 0,2), płyn A (pepton zwierzęcy 1,0 g/l, pH 7,1 ± 0,2), roztwór tryptonu z chlorkiem sodu do zawiesiny drożdży (tryptony 1,00 g, NaCl 8,50 g, pH 7,0 ± 0,2), agar Sabourauda z dekstrozą i chloramfenikolem (SDCA: dekstroza 40,0 g, pepton zwierzęcy 5,0 g, kazeina trawiona trzustkowo 5,0 g, chloramfenikol 0,050 g, agar 15,0 g, woda 1000 ml; sterylizacja 121 °C, 15 min; pH 5,6 ± 0,2) oraz agar Sabourauda z dekstrozą (SDA, bez chloramfenikolu) do hodowli szczepu odniesienia; dla produktów znanych i niezanieczyszczonych bakteriami podłoża stosuje się bez chloramfenikolu. Inne rozcieńczalniki, neutralizatory i podłoża można stosować po wykazaniu przydatności; dopuszczalne podłoża odwodnione i gotowe o porównywalnym składzie lub wydajności.

Zastosowania

• Rutynowa kontrola czystości mikrobiologicznej kosmetyków — liczba drożdży i pleśni (jtk/g, jtk/ml)
• Produkty na bazie wody o wysokim ryzyku (kremy, żele, balsamy) — zwalnianie serii
• Produkty o niskiej liczbie grzybów — wariant z filtracją membranową
• Badania skuteczności zakonserwowania — liczenie przeżywających drożdży i pleśni
• Produkty znane, niezanieczyszczone bakteriami — podłoże bez chloramfenikolu, wariant 22,5 °C / 5–7 dni

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 16212:2017-08 + A1:2023-01 (ISO 16212:2017 + Amd 1:2022)

Tytuł (PL)

Kosmetyki — Mikrobiologia — Oznaczanie liczby drożdży i pleśni

Title (EN)

Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould

Procedura krok po kroku

1. Zawiesina wyjściowa

   Pobierz co najmniej 1 g lub 1 ml produktu i sporządź zawiesinę wyjściową w rozcieńczalniku neutralizującym (np. SCDLP 20); przygotuj rozcieńczenia.

2. Sprawdzenie neutralizacji

   Sprawdź i wykaż skuteczność neutralizacji właściwości przeciwgrzybiczych produktu (rozdz. 12 normy, załącznik D — neutralizatory).

3. Wariant A — liczenie płytkowe

   Posiej określoną ilość zawiesiny wyjściowej lub rozcieńczenia wgłębnie lub powierzchniowo na agar SDCA (dla produktów niezanieczyszczonych bakteriami — bez chloramfenikolu).

4. Wariant B — filtracja membranowa

   Przenieś odpowiednią ilość próbki do aparatu filtracyjnego zwilżonego jałowym rozcieńczalnikiem, natychmiast przefiltruj, przemyj wg procedury i przenieś filtr na powierzchnię agaru (ISO 21148).

5. Inkubacja

   Inkubuj tlenowo w (25 ± 2,5) °C przez 3–5 dni; alternatywnie (22,5 ± 2,5) °C przez 5–7 dni na podłożu bez antybiotyku.

6. Liczenie i wynik

   Policz jtk i oblicz liczbę drożdży i pleśni na ml lub g produktu; w razie potrzeby zidentyfikuj drożdże (testy z norm z bibliografii) lub pleśnie (inne odpowiednie metody).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Pleśnie wytwarzają zarodniki — otwieranie płytek ostrożnie, praca w komorze; osoby uczulone unikają ekspozycji
• Chloramfenikol w podłożu — unikać wdychania proszku i kontaktu ze skórą przy ważeniu
• Gorące podłoża (łaźnia, autoklaw) — ryzyko poparzenia

Najczęstsze pytania