🔴 Cronobacter spp. (mleko w proszku)
Wykrywanie Cronobacter spp. (dawniej Enterobacter sakazakii) w mleku w proszku i preparatach dla niemowląt metodą wstępnego namnażania w BPW, selektywnego namnażania w mLST/wankomycyna i izolacji na agarze chromogennym CCI.
Przegląd
Cronobacter spp. (dawniej Enterobacter sakazakii) to patogen oportunistyczny stanowiący poważne zagrożenie dla noworodków i niemowląt, szczególnie wcześniaków i dzieci z obniżoną odpornością. Zakażenia Cronobacter mogą prowadzić do zapalenia opon mózgowych, posocznicy i martwiczego zapalenia jelit — śmiertelność sięga 40–80% u noworodków. Głównym źródłem zakażenia jest skażone mleko w proszku (preparaty do początkowego żywienia niemowląt — PIF).
Norma PN-EN ISO 22964 opisuje horyzontalną metodę wykrywania Cronobacter spp. w żywności, ze szczególnym uwzględnieniem mleka w proszku, preparatów dla niemowląt i próbek środowiskowych z zakładów produkcji tych produktów. Metoda obejmuje trzy etapy: wstępne namnażanie w wodzie peptonowej buforowanej (BPW), selektywne namnażanie w zmodyfikowanym bulionie laurylo-siarczynowo-tryptozowym z wankomycyną (mLST/vancomycin), oraz izolację na agarze chromogennym (CCI — Chromogenic Cronobacter Isolation Agar).
Cronobacter wykazuje charakterystyczną aktywność α-glukozydazy, która hydrolizuje substrat chromogenny w CCI agar, tworząc kolonie niebiesko-zielone (lub turkusowe). Wankomycyna w bulionie mLST hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich, umożliwiając selektywne namnożenie Cronobacter.
Cronobacter jest szczególnie niebezpieczny, ponieważ przeżywa w środowiskach o niskiej aktywności wodnej (mleko w proszku, mąki, herbatki ziołowe). Badanie jest wymagane przez Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 dla preparatów do początkowego żywienia niemowląt (kryterium: nieobecność w 10 g). Wynik „wykryto" skutkuje wycofaniem partii produktu z obrotu.
Zasada metody
Metoda trzyetapowa: (1) Wstępne namnażanie — 25 g próbki w 225 mL BPW, inkubacja 37°C/18 h — resuscytacja uszkodzonych komórek. (2) Namnażanie selektywne — 0,1 mL przesiew do 10 mL mLST z wankomycyną, inkubacja 44°C/24 h — selekcja Cronobacter (termofilny wzrost), wankomycyna hamuje Gram-dodatnie. (3) Izolacja — posiew na agar chromogenny CCI (Chromogenic Cronobacter Isolation Agar), inkubacja 44°C/24 h. Cronobacter produkuje α-glukozydazę, która hydrolizuje substrat chromogenny — kolonie niebiesko-zielone. Potwierdzenie: fermentacja cukrów, żółta pigmentacja na TSA, identyfikacja biochemiczna lub molekularna.
Zastosowania
- Kontrola jakości mleka w proszku dla niemowląt (PIF) — Rozporządzenie (WE) 2073/2005
- Badanie preparatów do początkowego żywienia niemowląt
- Monitoring środowiskowy zakładów produkcji mleka w proszku
- Kontrola surowców do produkcji preparatów dla niemowląt
- Badanie odżywek i żywności specjalnego przeznaczenia medycznego
- Monitoring herbat ziołowych, skrobi i mąk (rezerwuary Cronobacter)
- Walidacja procesów produkcyjnych i systemów mycia (CIP)
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Wstępne namnażanie | 37 ± 1°C, 18 ± 2 h w BPW |
| Namnażanie selektywne | 44 ± 1°C, 24 ± 2 h w mLST/wankomycyna |
| Izolacja | 44 ± 1°C, 24 ± 2 h na CCI agar |
| Podłoże izolacyjne | CCI Agar (Chromogenic Cronobacter Isolation Agar) |
| Typ kolonii | Niebiesko-zielone (turkusowe) — aktywność α-glukozydazy |
| Wielkość próbki | 10 × 25 g (łącznie 250 g dla PIF) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 22964:2017
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania Cronobacter spp.
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of Cronobacter spp.
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie próbki
Odważ 25 g mleka w proszku (PIF) do woreczka stomachera. Dodaj 225 mL wody peptonowej buforowanej (BPW) podgrzanej do 45°C. Wymieszaj do rozpuszczenia. Dla PIF bada się 10 × 25 g (łącznie 250 g).
2. Wstępne namnażanie w BPW
Inkubuj zawiesinę w 37 ± 1°C przez 18 ± 2 h. Faza resuscytacji — uszkodzone komórki Cronobacter odzyskują zdolność wzrostu.
3. Selektywne namnażanie w mLST/wankomycyna
Przenieś 0,1 mL namnożonej kultury do 10 mL bulionu mLST z wankomycyną (10 mg/L). Inkubuj 44 ± 1°C przez 24 ± 2 h.
4. Izolacja na CCI agar
Z pożółkłego bulionu mLST posiej eozę na płytkę CCI agar. Inkubuj 44 ± 1°C przez 24 ± 2 h.
5. Odczyt kolonii
Wyszukaj typowe kolonie Cronobacter — niebiesko-zielone (turkusowe), średnica 1–2 mm. Inne Enterobacteriaceae mogą rosnąć jako kolonie bezbarwne lub różowe.
6. Potwierdzenie wstępne
Wybierz min. 5 typowych kolonii. Przesiej na TSA i inkubuj 25°C przez 48–72 h. Cronobacter tworzy żółte/żółto-pomarańczowe kolonie (produkcja pigmentu).
7. Identyfikacja biochemiczna
Potwierdź izolaty za pomocą testów API 20E, VITEK 2 GN lub metod molekularnych (PCR). Cronobacter: oksydaza (−), katalaza (+), VP (+), argininowa dihydrolaza (−).
8. Raportowanie
Wynik: „Cronobacter spp. wykryto/nie wykryto w 25 g (lub 10 × 25 g) próbki". Wykrycie w PIF = natychmiastowe powiadomienie organów nadzoru i wycofanie partii.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator laboratoryjny 37°C | Binder BD 56, Memmert INB 200 | 5 000–18 000 PLN |
| Inkubator laboratoryjny 44°C | Binder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5 000–18 000 PLN |
| Komora laminarna klasy II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream | 25 000–60 000 PLN |
| Stomacher / homogenizator | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| Łaźnia wodna 44–47°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12 | 3 000–10 000 PLN |
| Autoklaw laboratoryjny | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Woda peptonowa buforowana (BPW) | — | Do wstępnego namnażania; pepton, NaCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄; op. 500 g |
| mLST Broth (modified Lauryl Sulphate Tryptose Broth) | — | Bulion selektywny; laurylosiarczan sodu, tryptoza, NaCl; op. 500 g |
| Wankomycyna (suplement do mLST) | 1404-93-9 | Antybiotyk hamujący bakterie Gram-dodatnie; stężenie 10 mg/L; op. 10 fiolek |
| CCI Agar (Chromogenic Cronobacter Isolation Agar) | — | Agar chromogenny z substratem dla α-glukozydazy; kolonie Cronobacter niebiesko-zielone; op. 500 g lub 20 płytek |
| TSA (Tryptone Soya Agar) | — | Podłoże nieselektywne do potwierdzenia — żółta pigmentacja Cronobacter po 48–72 h w 25°C |
| Testy biochemiczne API 20E lub VITEK | — | Do identyfikacji biochemicznej potwierdzonych izolatów |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Cronobacter — patogen BSL-2, szczególnie niebezpieczny dla noworodków i osób immunosupresyjnych
- Praca wyłącznie w komorze laminarnej klasy II — surowe przestrzeganie zasad aseptyki
- Wankomycyna — antybiotyk potencjalnie alergizujący, stosować rękawice
- Zużyte materiały autoklawować przed utylizacją (121°C/20 min)
- Dezynfekcja powierzchni 70% etanolem lub podchlorynem sodu 0,5%