🦠 Clostridium perfringens w żywności
Oznaczanie liczby Clostridium perfringens w żywności metodą posiewu zalewowego na agarze TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine) z inkubacją w warunkach beztlenowych w 37°C przez 20 ± 2 h.
Przegląd
Clostridium perfringens jest bezwzględnym beztlenowcem Gram-dodatnim, przetrwalnikującym, szeroko rozpowszechnionym w środowisku (gleba, kurz, przewód pokarmowy ludzi i zwierząt). Jest jedną z najczęstszych przyczyn bakteryjnych zatruć pokarmowych — CDC szacuje ok. 1 milion przypadków rocznie w USA. Zatrucie wywołuje enterotoksyna CPE (Clostridium perfringens enterotoxin), produkowana podczas sporulacji bakterii w jelicie.
Typowe zatrucie C. perfringens występuje po spożyciu dużej ilości bakterii (>10⁶ jtk/g) w niewłaściwie przechowywanych potrawach mięsnych (gulasz, sos mięsny, pieczeń), drobiu i roślinach strączkowych. Objawy (biegunka wodnista, skurcze brzucha) pojawiają się 8–22 h po spożyciu i ustępują w ciągu 24 h. Przetrwalniki C. perfringens przeżywają gotowanie i kiełkują podczas powolnego studzenia potraw (40–50°C), osiągając czas generacji zaledwie 8–10 min w optymalnych warunkach.
Norma PN-EN ISO 7937 opisuje horyzontalną metodę oznaczania liczby C. perfringens na podłożu TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine Agar). Podłoże zawiera siarczan sodu (IV) — redukcja siarczynu do siarczku przez C. perfringens powoduje wytrącanie siarczku żelaza(II) i tworzenie czarnych kolonii. D-cykloseryna hamuje wzrost bakterii towarzyszących. Inkubacja odbywa się w warunkach beztlenowych.
Potwierdzenie obejmuje test redukcji azotanów, test ruchliwości (C. perfringens jest nieruchliwy) i upłynnianie żelatyny. Metoda jest stosowana w kontroli jakości dań gotowych, potraw cateringowych, mięsa i produktów mięsnych.
Zasada metody
Próbkę posiewamy zalewowo na podłoże TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine Agar) z opcjonalnym dodatkiem emulsji żółtka jaja. C. perfringens redukuje siarczan(IV) sodu do siarczku, który reaguje z jonami żelaza(II) tworząc nierozpuszczalny czarny siarczek żelaza — kolonie są czarne. D-cykloseryna hamuje wzrost bakterii towarzyszących (szczególnie Gram-dodatnich tlenowców). Jeśli dodano emulsję żółtka — wokół kolonii C. perfringens pojawia się opalizujące halo (aktywność lecytynazy). Inkubacja w warunkach ściśle beztlenowych w 37°C przez 20 ± 2 h. Potwierdzenie: redukcja azotanów (+), ruchliwość (−), upłynnianie żelatyny (+).
Zastosowania
- Kontrola jakości dań gotowych i potraw cateringowych
- Badanie mięsa i przetworów mięsnych (gulasz, pieczeń, sos)
- Monitoring zakładów gastronomicznych i stołówek
- Kontrola żywności w instytucjach (szpitale, szkoły, domy opieki)
- Badanie roślin strączkowych i potraw z nich przygotowanych
- Postępowanie epidemiologiczne w ogniskach zatruć pokarmowych
- Weryfikacja procedur chłodzenia i podgrzewania potraw (HACCP)
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Temperatura inkubacji | 37 ± 1°C |
| Czas inkubacji | 20 ± 2 h |
| Atmosfera | Ściśle beztlenowa (anaerobioza) |
| Podłoże | TSC Agar (Tryptose Sulfite Cycloserine Agar) |
| Typ kolonii | Czarne, średnica 1–5 mm (redukcja siarczynu do siarczku żelaza) |
| Potwierdzenie | Redukcja azotanów (+), ruchliwość (−), żelatynaza (+) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 7937:2005
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby Clostridium perfringens — Metoda liczenia kolonii
- Title (EN)
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens — Colony-count technique
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie próbki
Odważ 10 g próbki, dodaj 90 mL BPW, homogenizuj w stomacherze 60–120 s. Przygotuj rozcieńczenia dziesiętne.
2. Przygotowanie podłoża TSC
Rozpuść TSC Agar Base w wodzie destylowanej. Sterylizuj w autoklawie (121°C/15 min). Schłodź do 45–50°C, dodaj aseptycznie D-cykloserynę (i opcjonalnie emulsję żółtka). Utrzymuj w łaźni wodnej 47°C.
3. Posiew zalewowy
Przenieś po 1 mL każdego rozcieńczenia na dwie sterylne płytki Petriego. Zalej ok. 15 mL podłoża TSC (44–47°C). Wymieszaj delikatnie. Pozostaw do zestalenia.
4. Nakładka (overlay)
Po zestaleniu nałóż dodatkową warstwę ok. 10 mL agaru TSC bez suplementów. Ogranicza to dostęp tlenu i rozprzestrzenianie się kolonii.
5. Inkubacja beztlenowa
Umieść płytki w jarze anaerobowym (dnem do góry). Włóż generator atmosfery beztlenowej (AnaeroGen) i wskaźnik anaerobiozy. Zamknij jar i inkubuj w 37 ± 1°C przez 20 ± 2 h.
6. Odczyt kolonii
Policz czarne kolonie (średnica 1–5 mm). Jeśli dodano żółtko — typowe kolonie otoczone opalizującym halo (lecytynaza+). Zliczaj płytki z 15–150 koloniami.
7. Potwierdzenie izolatów
Wybierz min. 5 typowych kolonii. Przesiej na agar z krwią w anaerobiozie (37°C/24 h). Wykonaj: redukcja azotanów (+ z odczynnikiem Griessa), ruchliwość w podłożu SIM (−), upłynnianie żelatyny w bulionie żelatynowym (+, 37°C/48 h).
8. Obliczenia i raportowanie
Oblicz liczbę C. perfringens z uwzględnieniem odsetka potwierdzonych kolonii. Wynik wyraź w jtk/g. Wynik raportuj jako „Clostridium perfringens".
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| System anaerobowy (jary + generatory) | Oxoid AnaeroJar 2,5 L + AnaeroGen, Merck Anaerocult A | 500–2 000 PLN (jar) + 300–500 PLN/10 gen. |
| Inkubator laboratoryjny 37°C | Binder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5 000–18 000 PLN |
| Komora laminarna klasy II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream AC2 | 25 000–60 000 PLN |
| Stomacher / homogenizator | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| Łaźnia wodna 44–47°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12 | 3 000–10 000 PLN |
| Autoklaw laboratoryjny | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| TSC Agar Base (Tryptose Sulfite Cycloserine) | 7681-57-4 | Tryptoza, peptone sojowe, ekstrakt drożdżowy, siarczan(IV) sodu, cytrynian żelaza(III) amonu, agar; op. 500 g |
| D-Cykloseryna (suplement selektywny) | 68-41-7 | Antybiotyk hamujący wzrost bakterii towarzyszących; stężenie 400 mg/L; op. 10 fiolek |
| Emulsja żółtka jaja (opcjonalnie) | — | Wykrywa aktywność lecytynazy C. perfringens — opalizujące halo wokół kolonii; 50 mL/L |
| Siarczan(IV) sodu (siarczyn sodu) | 7757-83-7 | Redukowany przez C. perfringens do siarczku; składnik TSC |
| Cytrynian żelaza(III) amonu | 1185-57-5 | Dostarcza jonów żelaza reagujących z siarczkiem — czarne kolonie; składnik TSC |
| Generatory atmosfery beztlenowej | — | Oxoid AnaeroGen 2,5 L lub Merck Anaerocult A; op. 10 szt. |
| Bulion żelatynowy i odczynnik Griessa | — | Do testów potwierdzenia: żelatynaza i redukcja azotanów |
| Woda peptonowa buforowana (BPW) | — | Do rozcieńczeń próbki, op. 500 g |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- C. perfringens — patogen BSL-2 wytwarzający toksyny i przetrwalniki, stosować pełne ŚOI
- Warunki beztlenowe — ostrożność przy otwieraniu jarów anaerobowych (nagły napływ tlenu)
- D-Cykloseryna — antybiotyk, neurotoksyczny w dużych dawkach, unikać wdychania i kontaktu ze skórą
- Praca w komorze laminarnej klasy II obowiązkowa
- Zużyte materiały autoklawować (121°C/30 min) — przetrwalniki wymagają dłuższej sterylizacji
- Siarczyn sodu — może uwalniać SO₂, wentylacja pomieszczenia