🦠 Clostridium perfringens w wodzie
Oznaczanie ilościowe wegetatywnych komórek i przetrwalników Clostridium perfringens w wodzie metodą filtracji membranowej na podłożu TSC w warunkach beztlenowych.
Przegląd
Clostridium perfringens jest beztlenową, przetrwalnikującą bakterią Gram-dodatnią, której obecność w wodzie wskazuje wyłącznie na zanieczyszczenie kałowe. Spory (przetrwalniki) C. perfringens są niezwykle odporne na dezynfekcję chemiczną (chlorowanie, ozonowanie), promieniowanie UV, zmiany pH i temperatury — mogą przetrwać w środowisku wodnym przez miesiące, a nawet lata.
Ta wyjątkowa odporność czyni C. perfringens cennym wskaźnikiem uzupełniającym do E. coli i enterokoków. Wykrycie przetrwalników C. perfringens w wodzie uzdatnionej wskazuje na niewystarczającą skuteczność procesów filtracji i może świadczyć o dawnym zanieczyszczeniu kałowym, nawet gdy E. coli i enterokoki są już niewykrywalne.
Metoda według PN-EN ISO 14189 obejmuje filtrację membranową próbki wody, umieszczenie membrany na podłożu TSC (Tryptose Sulphite Cycloserine — agar tryptozowo-siarczynowo-cykloserynowy) i inkubację w warunkach beztlenowych w temperaturze 44±1°C przez 21±3 godziny. C. perfringens redukuje siarczyny do siarczków, które reagują z solą żelazową w podłożu, tworząc czarne kolonie. Cykloseryna hamuje wzrost gatunków Bacillus.
C. perfringens jest parametrem wskaźnikowym wody pitnej wg Rozporządzenia MZ. Jego wykrycie w wodzie uzdatnionej powinno skutkować oceną efektywności procesu filtracji i weryfikacją systemu barier w oczyszczalni wody.
Zasada metody
Próbkę wody (lub jej rozcieńczenie) filtruje się przez membranę 0,45 µm, którą następnie umieszcza się na powierzchni podłoża TSC (Tryptose Sulphite Cycloserine agar). Podłoże zawiera siarczyn sodu (Na₂SO₃) i cytrynian żelazowo-amonowy — C. perfringens redukuje siarczyn do siarczku (S²⁻), który z jonami żelaza tworzy czarny osad FeS, dając charakterystyczne czarne kolonie. Cykloseryna (400 mg/L) selektywnie hamuje Bacillus spp. Inkubacja w warunkach beztlenowych (jar anaerobowy z generatorem gazowym) w temperaturze 44±1°C wzmacnia selektywność wobec C. perfringens.
Zastosowania
- Kontrola jakości wody pitnej — parametr wskaźnikowy (Rozporządzenie MZ)
- Ocena skuteczności procesów filtracji w stacjach uzdatniania wody
- Wykrywanie dawnego zanieczyszczenia kałowego wód podziemnych
- Monitoring wód powierzchniowych wykorzystywanych jako źródła wody pitnej
- Badanie wody po awariach sieci wodociągowej
- Ocena integralności systemów membranowych (UF, NF) w oczyszczalniach
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Wynik | jtk/100 mL (jednostki tworzące kolonie) |
| Dopuszczalna wartość (woda pitna) | 0 jtk/100 mL (łącznie ze sporami) |
| Temperatura inkubacji | 44 ± 1°C |
| Czas inkubacji | 21 ± 3 godziny |
| Warunki inkubacji | Beztlenowe (anaerobioza) |
| Objętość próbki | 100 mL (standardowo) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 14189:2016
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Clostridium perfringens — Metoda filtracji membranowej
- Title (EN)
- Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens — Method using membrane filtration
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie stanowiska
Wysterylizuj zestaw filtracyjny. Przygotuj płytki TSC z suplementem cykloserynowym. Sprawdź temperaturę inkubatora (44°C).
2. Wstępne ogrzanie próbki (opcjonalnie)
Dla oznaczania wyłącznie przetrwalników: ogrzej próbkę w łaźni wodnej 75°C przez 15 min — zabija formy wegetatywne. Dla form wegetatywnych + spory: pomiń ten krok.
3. Neutralizacja chloru
Dodaj tiosiarczan sodu do próbki wody sieciowej. Wymieszaj.
4. Filtracja membranowa
Przefiltruj 100 mL próbki przez sączek 0,45 µm. Przepłucz lejek sterylną wodą peptonową.
5. Umieszczenie na podłożu TSC
Przenieś sączek sterylną pęsetą na powierzchnię podłoża TSC. Zalej cienką warstwą podłoża TSC (overlay 5 mL), aby stworzyć warunki beztlenowe na powierzchni.
6. Inkubacja beztlenowa
Umieść płytkę w jarze anaerobowym. Włóż saszetkę AnaeroGen i pasek wskaźnikowy. Zamknij szczelnie jar. Inkubuj w 44±1°C przez 21±3 h.
7. Odczyt wyników
Otwórz jar. Policz czarne kolonie w ciągu 30 minut — barwa szybko blednie po kontakcie z powietrzem! Czarne/szare kolonie = domniemane C. perfringens.
8. Potwierdzenie — test fosfatazy kwasowej
Przenieś kolonie na bibułę filtracyjną. Nałóż odczynnik fosfatazy kwasowej (α-naftylu fosforan). Różowe zabarwienie w 1–2 min = fosfataza kwasowa (+) = potwierdzone C. perfringens.
9. Subkultura na agarze krwawym (opcjonalnie)
Przenieś kolonie na agar krwawy. Inkubuj beztlenowo 37°C/24 h. C. perfringens daje podwójną strefę hemolizy (beta-hemoliza).
10. Obliczenie wyniku
Wynik = liczba potwierdzonych czarnych kolonii / objętość próbki × 100. Podaj w jtk/100 mL.
11. Kontrola jakości
Kontrola pozytywna: C. perfringens ATCC 13124. Kontrola negatywna: sterylna woda. Sprawdź pasek wskaźnikowy anaerobiozy.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| System filtracji membranowej | Sartorius Combisart, Merck EZ-Fit | 3 000–12 000 PLN |
| Jar anaerobowy 2,5 L | Oxoid AG0025A, Merck Anaerocult | 800–2 000 PLN |
| Generatory atmosfery beztlenowej | Oxoid AnaeroGen AN0025A, Merck Anaerocult A | 50–100 PLN/szt. (saszetki) |
| Inkubator 44°C | Binder BD 56, Memmert IN30plus | 6 000–18 000 PLN |
| Pompa próżniowa | KNF Laboport N 810 | 3 000–8 000 PLN |
| Autoklaw | Tuttnauer ELV 2540 | 20 000–45 000 PLN |
| Lupa / licznik kolonii | Stuart SC6+, Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Agar TSC (Tryptose Sulphite Cycloserine) | — | Podłoże selektywne bez żółtka jaja. Skład: hydrolizat kazeiny, ekstrakt drożdżowy, siarczyn sodu, cytrynian żelazowo-amonowy, agar. Producenci: Oxoid, Merck, Biokar |
| Suplement cykloserynowy | 68-41-7 | D-Cykloseryna, stężenie końcowe 400 mg/L. Hamuje wzrost Bacillus spp. |
| Sączki membranowe 0,45 µm | — | MCE, 47 mm, sterylne. Merck Millipore, Sartorius |
| Saszetki AnaeroGen | — | Generatory atmosfery beztlenowej do jarów 2,5 L. Redukcja O₂ < 1% w 30 min |
| Paski wskaźnikowe anaerobiozy | — | Oxoid Anaerobic Indicator BR0055 — kontrola warunków beztlenowych w jarze |
| Odczynnik do testu fosfatazy kwasowej | — | Roztwór α-naftylu fosforanu + odczynnik diazowy. Do potwierdzenia C. perfringens (fosfataza kwasowa+) |
| Agar krwawy (odżywczy z 5% krwi baraniej) | — | Do subkultury i potwierdzenia hemolitycznego C. perfringens |
| Tiosiarczan sodu (Na₂S₂O₃) | 7772-98-7 | Neutralizacja chloru w próbkach wody sieciowej |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- C. perfringens wytwarza toksyny (alfa, beta, epsilon, jota) — potencjalnie niebezpieczny patogen. Pełne środki ochrony osobistej
- Praca w warunkach beztlenowych — jary pod ciśnieniem, otwierać ostrożnie
- Cykloseryna — antybiotyk, unikać kontaktu ze skórą, pracować w rękawicach
- Azydek sodu (w podłożach) — silnie toksyczny, nie zakwaszać (uwalnia toksyczny HN₃)
- Materiał zakaźny — autoklaw 121°C/30 min przed utylizacją
- Odczynnik fosfatazy kwasowej — drażniący, stosować w wyciągu