🦠 Clostridium spp. redukujące siarczany(IV) w żywności, paszach, próbkach środowiskowych i z produkcji pierwotnej — posiew wgłębny na agarze siarczynowym z żelazem z nadwarstwą, inkubacja beztlenowa 37 °C, 48 h, potwierdzenie kolonii, opcjonalnie tylko przetrwalniki po 10 min w 80 °C, PN-EN ISO 15213-1

Mikrobiologia PN-EN ISO 15213-1

Przegląd

CO TA NORMA OPISUJE. Zakres z karty PKN, w całości: „Niniejszy dokument określa sposób oznaczania liczby beztlenowców redukujących siarczany(IV) oraz bakterii z rodzaju Clostridium spp. redukujących siarczany(IV) metodą liczenia kolonii. Norma ma zastosowanie do: — produktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi; — produktów przeznaczonych do żywienia zwierząt; — próbek środowiskowych w obszarze produkcji żywności i pasz, obrotu oraz — próbek pochodzących z etapu produkcji pierwotnej. UWAGA Metoda ta została zwalidowana w badaniu międzylaboratoryjnym dla następujących kategorii żywności: — produkty mięsne gotowe do spożycia, gotowe do odgrzania; — jaja i produkty jajeczne (pochodne); — przetworzone owoce i warzywa; — preparaty do początkowego żywienia niemowląt i płatki zbożowe dla niemowląt; — żywność wieloskładnikowa lub składniki posiłków. Została również zwalidowana dla innych kategorii produktów tj.: — karma dla zwierząt domowych i pasza dla zwierząt; — próbki środowiskowe (pobrane ze środowiska produkcji żywności lub pasz). Niniejsza metoda została zwalidowana dla co najmniej pięciu kategorii żywności, dlatego też ma ona zastosowanie do szerokiej gamy produktów spożywczych. Szczegółowe informacje na temat walidacji znajdują się w Rozdziale 11 i Załączniku C. Ze względu na to, że metoda ta nie jest powszechnie stosowana w przypadku próbek pochodzących z etapu produkcji pierwotnej, ta kategoria nie została uwzględniona w badaniach walidacyjnych. W związku z tym, nie uzyskano odpowiednich wartości parametrów walidacyjnych dla tej kategorii. Przedstawiona metoda jest odpowiednia (ale nie wyłącznie) do oznaczania liczby drobnoustrojów w próbkach badanych i opiera się na oznaczaniu co najmniej 10 kolonii na płytce. Odpowiada to poziomowi zanieczyszczenia, który powinien być wyższy niż 10 jtk/ml dla próbek płynnych lub wyższy niż 100 jtk/g dla próbek stałych.” Tekst angielski ISO mówi w pierwszym zdaniu tylko o Clostridium spp. redukujących siarczany(IV). Mamy fragment próbny ISO 15213-1:2023 (wydanie pierwsze) od okładki do punktu 9.4.4 (strona 5).

WEDŁUG WYDANIA 2023 (przedmowa, wstęp, rozdz. 1–9.4.4). Normę przygotował ISO/TC 34/SC 9 „Microbiology” we współpracy z CEN/TC 463 (porozumienie wiedeńskie); zastąpiła ISO 15213:2003, a zmiany uznano za duże (według ISO 17468), z dużym wpływem na charakterystyki metody: zakres objął próbki z produkcji pierwotnej; wielkość zmieniono z „bakterii redukujących siarczany(IV)” na „Clostridium spp. redukujące siarczany(IV)”, więc typowe kolonie się potwierdza; zawartość siarczanu(IV) w agarze siarczynowym z żelazem obniżono z 1,0 g/l do 0,5 g/l; ogrzewanie 10 min w 80 °C stało się opcjonalne (przy dużej florze towarzyszącej albo gdy liczy się tylko przetrwalniki); usunięto posiew w probówkach i inkubację w 50 °C dla termofilnych bakterii redukujących siarczany(IV); dodano opis potwierdzania, nowy schemat w załączniku A, charakterystyki w załączniku C i specjalny protokół dla pasz w załączniku D. Wstęp: Clostridium spp. redukujące siarczany(IV) to bezwzględne beztlenowce, Gram-dodatnie, przetrwalnikujące pałeczki — m.in. C. perfringens, C. bifermentans, C. sporogenes, C. botulinum — wskaźniki zanieczyszczenia; liczbę C. perfringens opisuje ISO 15213-2, a jego wykrywanie ISO/TS 15213-3. Zasada (rozdz. 4): określoną objętość próbki płynnej albo zawiesiny wstępnej miesza się w pustej płytce z roztopionym agarem (posiew wgłębny), po zestaleniu nalewa nadwarstwę, która zapobiega rozrastaniu się kolonii; płytki inkubuje się w warunkach beztlenowych w 37 °C przez 48 h i liczy kolonie typowe — czarne albo szare do żółtobrązowych, zabarwione siarczkiem żelaza(II) powstającym z jonów siarczkowych i żelaza(III) w podłożu; typowe kolonie potwierdza się; UWAGA: bez potwierdzenia wynik można podać jako „beztlenowe bakterie redukujące siarczany(IV)”. Przy liczbie bliskiej granicy oznaczania lepiej posiewać po dwie płytki — suma kolonii na obu co najmniej 10, co odpowiada więcej niż 5 jtk/ml albo 50 jtk/g. Wynik podaje się w jtk na gram, mililitr, centymetr kwadratowy albo na urządzenie do pobierania. Sprzęt (rozdz. 6): atmosfera beztlenowa poniżej 1 % tlenu i od 9 % do 13 % dwutlenku węgla (słój, komora albo saszetki), cieplarka 37 °C ± 1 °C, pH-metr ± 0,1 w 25 °C, chłodziarka 5 °C ± 3 °C, pipety 10 ml i 1 ml, ezy około 1 µl, płytki Petriego około 90 mm i opcjonalnie około 140 mm, łaźnia wodna 44–47 °C i 80 °C ± 2 °C. Pobieranie próbek nie jest częścią metody — zalecane dokumenty: ISO/TS 17728 (żywność i pasze), ISO 707 (mleko), ISO 6887-3, ISO 13307 (produkcja pierwotna), ISO 17604 (tusze), ISO 18593 (powierzchnie); przygotowanie według serii ISO 6887, dla pasz według załącznika D. Tylko przetrwalniki (9.3): serię rozcieńczeń ogrzewa się w łaźni 80 °C przez 10 min ± 1 min, najpóźniej 15 min po przygotowaniu zawiesiny wstępnej (inaczej w lodzie najwyżej 2 h); temperaturę kontroluje termometr w butelce odniesienia; dojście do 80 °C nie dłużej niż 5 min (woda co najmniej 4 cm ponad poziomem próbki, pompa obiegowa), czas liczy się od osiągnięcia 80 °C w butelce odniesienia, potem szybkie schłodzenie do około 20 °C; ogrzewanie ogranicza też florę towarzyszącą (np. płynna serwatka, kiszonka). Posiew (9.4): na dwie płytki 90 mm po 1 ml próbki płynnej albo zawiesiny wstępnej (10⁻¹), na kolejną 1 ml rozcieńczenia 10⁻¹ (płynne) albo 10⁻² (inne); granicę oznaczania można obniżyć dziesięciokrotnie, badając 10 ml zawiesiny wstępnej na trzech płytkach 140 mm; wybiera się rozcieńczenia dające od 10 do 150 kolonii na płytce 90 mm albo od 10 do 360 na płytce 140 mm.

STATUS (stan kart na 30.09.2026). Karta PN-EN ISO 15213-1:2023-08 (wersja angielska) nie ma nagłówka „Wycofana” — norma jest AKTUALNA: publikacja 08-08-2023, 34 strony, grupa cenowa Q, Sektor Żywności, Rolnictwa i Leśnictwa, KT 3 Mikrobiologii Łańcucha Żywnościowego, ICS 07.100.30, „Wprowadza: EN ISO 15213-1:2023 [IDT], ISO 15213-1:2023 [IDT]”, „Zastępuje: PN-ISO 15213:2005 - wersja polska”, poprawka Ap1:2024-02. Poprawka krajowa PN-EN ISO 15213-1:2023-08/Ap1:2024-02 (zatwierdzona 22 lutego 2024 r., plik z karty przeczytany) dopisała na stronie tytułowej w polu „Zastępuje” PN-ISO 15213:2005, a w przedmowie krajowej zdanie „Niniejsza norma zastępuje PN-ISO 15213:2005”. Karta PN-ISO 15213:2005 „Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby bakterii redukujących siarczany(IV) rosnących w warunkach beztlenowych” — „Wycofana i zastąpiona przez PN-EN ISO 15213-1:2023-08”: publikacja 29-06-2005, „Data wycofania: 23-02-2024”, 12 stron, wprowadzała ISO 15213:2003, zastąpiła PN-A-86034-12:1993. Wyszukiwarka PKN pod hasłem „PN-EN ISO 15213” (30.09.2026): PN-EN ISO 15213-1:2023-08 i PN-EN ISO 15213-2:2024-05 bez etykiet, PN-ISO 15213:2005 — „Wycofana i zastąpiona przez”, oraz normy PN-EN 15213-1…5 z innej dziedziny (systemy transportowe).

ILE LABORATORIÓW I W JAKIEJ POSTACI (kopia bazy zakresów akredytacji, wsad do 17.09.2026, odczyt 30.09.2026). Wszystkie zapisy numeru 15213-1: 11 rekordów u 10 laboratoriów; w aktualnych dokumentach PCA numer stoi w 13 komórkach — AB 924 ma w wydaniu nr 25 z 16.09.2026 trzy pozycje, kopia jedną. Zapis „PN-EN ISO 15213-1:2023-08” — 8 laboratoriów, w tym z poprawką Ap1:2024-02 — AB 285, AB 313, AB 370, AB 819, AB 924 (AB 285 jako „PN_EN ISO 15213-1:2023-08/Ap1:2024-02”); AB 400 zapisuje „PN-EN ISO 15213-1” i w drugiej pozycji „PN-ISO 15213-1”, AB 1179 — „PN-ISO 15213-1:2023-08” (postaci, której w katalogu PKN nie ma); AB 370 powołuje normę „z wyłączeniem pkt 9.6” (potwierdzania). Zakładka „Laboratoria” szuka zapisów ZACZYNAJĄCYCH SIĘ od „PN-EN ISO 15213-1” i pokaże 9 laboratoriów — nie pokaże AB 1179; sprawdzone zapytaniem zakładki na serwerze produkcyjnym labcoda.pl 30.09.2026: 9 (pod „PN-ISO 15213-1” — 2). Aktualne zakresy na stronach PCA (odczyt 30.09.2026, wydania od 30.10.2025 do 16.09.2026): pozycje z tą normą nie są zawieszone (AB 1179 ma zawieszoną inną część zakresu).

WIELKOŚĆ I PRZEDMIOT. Nazwa wielkości: „Liczba Clostridium spp. redukujących siarczany (IV)” — 7 laboratoriów (AB 285, AB 313, AB 400, AB 452, AB 462, AB 924, AB 1415); „Liczba bakterii beztlenowych redukujących siarczany (IV)” — AB 819; „Liczba przetrwalników bakterii beztlenowych redukujących siarczany (IV)” — AB 370; „Liczba bakterii redukujących siarczany (IV) rosnących w warunkach beztlenowych” — AB 1179 (brzmienie tytułu wycofanej PN-ISO 15213:2005). Technika: metoda płytkowa, posiew wgłębny — 9 laboratoriów, AB 452 — „metoda horyzontalna”. Przedmiot: żywność — mleko i przetwory mleczne, mięso i przetwory mięsne, ryby, owoce i warzywa i ich przetwory, koncentraty, słodycze, przetwory zbożowe, jaja, żywność mrożona, wyroby garmażeryjne (u AB 285 także sok jabłkowy); AB 400 — żywność w zakresie elastycznym. Pozycje nie mają zakresów liczbowych.

OBOK TEJ NORMY. Wycofaną PN-ISO 15213:2005 mają w aktualnych zakresach trzy laboratoria: AB 285 (dwie pozycje — bakterie beztlenowe redukujące siarczany(IV) i ich przetrwalniki — obok pozycji według nowej normy, wydanie nr 28 z 13.01.2026), AB 418 (przetrwalniki beztlenowców, w tym redukujących siarczany(IV), w odpadach) i AB 1866 (liczba drobnoustrojów beztlenowych redukujących siarczany(IV) w środkach wspomagających uprawę roślin, wydanie nr 4 z 09.06.2026). Jakościowe badanie „obecności beztlenowych bakterii przetrwalnikujących i beztlenowych bakterii redukujących siarczany(IV)” według PN-A-82055-12 prowadzi w aktualnych zakresach 5 laboratoriów (AB 400, AB 462, AB 483, AB 510, AB 1415; kopia ma jeszcze AB 437, którego wydanie z 10.09.2026 tej pozycji nie zawiera). W wodzie przetrwalniki clostridiów redukujących siarczyny oznacza się metodą filtracji membranowej według PN-EN 26461-2, a liczbę Clostridium perfringens w żywności — według PN-EN ISO 15213-2 (obie mają osobne wpisy w Bazie Wiedzy).

GDZIE ŁATWO O WYNIK POZORNIE POPRAWNY. Pierwsze — z potwierdzeniem czy bez: wynik „Clostridium spp. redukujące siarczany(IV)” wymaga potwierdzenia typowych kolonii; bez niego norma pozwala podać tylko „beztlenowe bakterie redukujące siarczany(IV)” — AB 370 wyłącza punkt 9.6 i nazywa wielkość „przetrwalniki bakterii beztlenowych redukujących siarczany (IV)”. Drugie — przetrwalniki czy komórki wegetatywne: ogrzewanie 10 min w 80 °C jest opcjonalne; wynik po ogrzaniu dotyczy tylko przetrwalników i nie jest porównywalny z wynikiem bez ogrzewania — sprawozdanie musi to podać. Trzecie — stara i nowa metoda: wydanie 2023 ma podłoże z mniejszą zawartością siarczanu(IV) (0,5 g/l zamiast 1,0 g/l), bez inkubacji w 50 °C i bez posiewu w probówkach — wyniki według wycofanej PN-ISO 15213:2005 nie są wymienne z wynikami według tej normy. Czwarte — granica: liczenie wymaga co najmniej 10 kolonii na płytce — więcej niż 10 jtk/ml albo 100 jtk/g; przy dwóch płytkach suma co najmniej 10 — więcej niż 5 jtk/ml albo 50 jtk/g; niższe poziomy wymagają posiewu 10 ml zawiesiny na płytkach 140 mm. Piąte — beztlenowość: atmosfera poniżej 1 % tlenu przez cały czas inkubacji; przy nieszczelnym słoju kolonii będzie mniej.

CZEGO NIE PODAJEMY. Fragment kończy się na punkcie 9.4.4: nie podajemy przebiegu dalszego posiewu i nalewania nadwarstwy (9.4.5 i dalej), liczenia kolonii typowych (9.5), potwierdzania (9.6), wyrażania wyników (10), danych walidacyjnych (11, załącznik C), składu podłoży (załącznik B) ani protokołu dla pasz (załącznik D).

Zasada metody

Próbkę płynną albo zawiesinę wstępną i jej rozcieńczenia miesza się w płytkach Petriego z roztopionym agarem siarczynowym z żelazem, po zestaleniu przykrywa nadwarstwą i inkubuje beztlenowo w 37 °C przez 48 h. Clostridium spp. redukujące siarczany(IV) tworzą kolonie czarne albo szare do żółtobrązowych (siarczek żelaza(II)); kolonie typowe liczy się i potwierdza, a wynik podaje w jtk/g, jtk/ml, jtk/cm² albo na urządzenie do pobierania. Gdy liczy się tylko przetrwalniki, rozcieńczenia ogrzewa się 10 min w 80 °C.

Zastosowania

• Żywność — mleko i przetwory mleczne, mięso, ryby, owoce i warzywa, koncentraty, słodycze, przetwory zbożowe, jaja, żywność mrożona — w zakresach 10 laboratoriów
• Pasze i karma dla zwierząt, próbki środowiskowe z produkcji żywności i pasz, próbki z produkcji pierwotnej — według zakresu normy

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 15213-1:2023-08 (wersja angielska; EN ISO 15213-1:2023, ISO 15213-1:2023 IDT) z poprawką PN-EN ISO 15213-1:2023-08/Ap1:2024-02

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Clostridium spp. — Część 1: Oznaczanie liczby Clostridium spp. redukujących siarczany(IV) metodą liczenia kolonii

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 1: Enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by colony-count technique

Procedura krok po kroku

1. Próbka i rozcieńczenia

   Przygotowanie według serii ISO 6887 (pasze — załącznik D); jedna seria rozcieńczeń dziesiętnych. PN-EN ISO 15213-1:2023-08 aktualna (stan karty na 30.09.2026).

2. Tylko przetrwalniki (opcja)

   Ogrzać rozcieńczenia w łaźni 80 °C przez 10 min ± 1 min, najpóźniej 15 min po przygotowaniu zawiesiny; dojście do 80 °C ≤ 5 min; schłodzić do ok. 20 °C.

3. Posiew wgłębny

   Po 1 ml próbki płynnej albo zawiesiny 10⁻¹ na dwie płytki 90 mm, 1 ml kolejnego rozcieńczenia na następną; dla niskich poziomów 10 ml zawiesiny na trzy płytki 140 mm; agar siarczynowy z żelazem i nadwarstwa.

4. Inkubacja

   Beztlenowo (< 1 % O₂, 9–13 % CO₂), 37 °C, 48 h.

5. Liczenie, potwierdzenie, wynik

   Kolonie czarne albo szare do żółtobrązowych na płytkach z 10–150 koloniami (90 mm); potwierdzenie typowych kolonii (9.6 — NIE PODAJEMY); bez potwierdzenia wynik jako „beztlenowe bakterie redukujące siarczany(IV)”.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Hodowle mogą zawierać chorobotwórcze gatunki Clostridium (C. perfringens, C. botulinum) — badania tylko w odpowiednio wyposażonym laboratorium, pod nadzorem mikrobiologa, z bezpiecznym usuwaniem inkubowanych materiałów (ostrzeżenie normy)
• UWAGA MERYTORYCZNA: bez potwierdzenia kolonii wynik to „beztlenowe bakterie redukujące siarczany(IV)”, nie Clostridium spp.; wyniki według wycofanej PN-ISO 15213:2005 nie są wymienne z wynikami według tej normy

Najczęstsze pytania