🦠 Clostridium perfringens w żywności i paszach — posiew wgłębny z warstwą przykrywającą na agarze TSC (37 °C, 20 h, beztlenowo)

Mikrobiologia PN-EN ISO 15213-2

Przegląd

ISO 15213-2:2023 określa oznaczanie liczby Clostridium perfringens metodą liczenia kolonii. Stosuje się ją do produktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi, pasz, próbek środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością i paszami oraz próbek z produkcji pierwotnej. Metoda została zwalidowana w badaniu międzylaboratoryjnym dla produktów mięsnych gotowych do spożycia i do odgrzania, jaj i przetworów jajecznych, przetworzonych owoców i warzyw, preparatów i kaszek dla niemowląt oraz żywności wieloskładnikowej, a także dla karm dla zwierząt, pasz i próbek środowiskowych — ponieważ objęła co najmniej pięć kategorii, ma zastosowanie do szerokiego zakresu żywności (rozdz. 11, załącznik C). W tym wydaniu obróbka cieplna 10 min w 80 °C stała się opcjonalna (przy wysokiej mikroflorze towarzyszącej); załącznik D opisuje metodę molekularnego różnicowania szczepów C. perfringens patogennych dla człowieka i niepatogennych.

Gdy spodziewana liczba jtk jest bliska granicy oznaczalności, zaleca się płytki podwójne (suma kolonii na obu ≥ 10, co odpowiada zanieczyszczeniu > 5 jtk/ml dla cieczy lub > 50 jtk/g dla produktów stałych). Posiew wgłębny z warstwą przykrywającą jest szczególnie przydatny dla produktów, w których spodziewane są kolonie rozpełzłe zasłaniające kolonie docelowe. W Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 15213-2:2024-05 (wersja angielska). Agar tryptozowo-siarczynowy (TSC) z suplementem D-cykloseryny jest w Polsce dostępny jako podłoże handlowe (proszek, butelki, płytki).

Zasada metody

Określoną ilość ciekłej próbki lub zawiesiny wyjściowej (dla innych produktów) umieszcza się w pustej płytce Petriego i miesza ze stopionym podłożem agarowym (płytka wgłębna); kolejne płytki przygotowuje się z rozcieńczeń dziesiętnych wg serii ISO 6887. Po zestaleniu nakłada się warstwę przykrywającą z tego samego agaru, aby zapobiec rozwojowi kolonii rozpełzłych. Jeżeli liczy się tylko przetrwalniki, serię rozcieńczeń ogrzewa się przed posiewem 10 min ± 1 min w 80 °C (w łaźni wodnej, w ciągu 15 min od sporządzenia zawiesiny, inaczej probówki w topniejącym lodzie do 2 h; czas do osiągnięcia 80 °C ≤ 5 min; po ogrzaniu natychmiastowe schłodzenie do ok. 20 °C). Do dwóch płytek (ok. 90 mm) przenosi się po 1 ml próbki ciekłej lub zawiesiny wyjściowej (przy małej spodziewanej liczbie granicę można obniżyć 10-krotnie, badając 10 ml), do kolejnej 1 ml rozcieńczenia 10⁻¹ (produkt ciekły) lub 10⁻² (inne produkty) itd., wybierając co najmniej dwa kolejne krytyczne stopnie rozcieńczeń. Wlewa się 12–15 ml (płytki 90 mm) lub 30–35 ml (140 mm) agaru TSC stopionego i utemperowanego do 44–47 °C, miesza obrotowo, a po zestaleniu nakłada ok. 5 ml (90 mm) lub 12 ml (140 mm) agaru TSC jako warstwę przykrywającą. Płytki inkubuje się odwrócone w atmosferze beztlenowej w 37 °C przez 20 h ± 2 h; po wyjęciu z atmosfery beztlenowej liczy się w ciągu 30 min kolonie typowe — czarne lub szare do żółtobrązowych, których barwa wraz z otaczającą strefą pochodzi od siarczku żelaza(II) powstającego z jonów siarczkowych i żelaza(III) obecnego w podłożu — na płytkach zawierających < 150 kolonii przypuszczalnych (90 mm). Potwierdzenie: z każdej płytki 5 kolonii przesiewa się na nieselektywny agar z krwią (lub odżywczy) i inkubuje beztlenowo w 37 °C 20 h ± 2 h (płytki można chłodzić w 5 °C do 48 h przed odczytem), następnie wykonuje test fosfatazy kwaśnej (kolonie rozetarte na bibule z odczynnikiem; purpurowe zabarwienie w ciągu 3–4 min = dodatni) oraz test w agarze siarczynowo-indolowo-ruchowym (SIM, 22 h ± 2 h w 37 °C: redukcja siarczynu, indol, ruch). Wynik oblicza się jako liczbę potwierdzonych C. perfringens na objętość próbki; załącznik D umożliwia molekularne odróżnienie szczepów patogennych dla człowieka.

Zastosowania

• Produkty mięsne gotowe do spożycia i do odgrzania, dania wieloskładnikowe, catering — wskaźnik zatruć pokarmowych
• Jaja i przetwory jajeczne, przetworzone owoce i warzywa, preparaty i kaszki dla niemowląt (kategorie zwalidowane)
• Pasze i karmy dla zwierząt, próbki środowiskowe z produkcji żywności i pasz, produkcja pierwotna
• Liczenie wyłącznie przetrwalników po obróbce cieplnej 80 °C/10 min (np. ocena skuteczności obróbki termicznej)
• Różnicowanie szczepów patogennych dla człowieka i niepatogennych (metoda molekularna z załącznika D)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 15213-2:2024-05 (ISO 15213-2:2023)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Clostridium spp. — Część 2: Oznaczanie liczby Clostridium perfringens metodą liczenia kolonii

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 2: Enumeration of Clostridium perfringens by colony-count technique

Procedura krok po kroku

1. Naważka, zawiesina i rozcieńczenia

   Przygotuj zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesiętne wg serii ISO 6887.

2. Opcjonalna selekcja przetrwalników

   Jeśli liczysz tylko przetrwalniki: ogrzej serię rozcieńczeń w łaźni 80 °C przez 10 min ± 1 min (start po osiągnięciu 80 °C w próbce odniesienia; dojście ≤ 5 min), w ciągu 15 min od sporządzenia zawiesiny (inaczej przechowaj w topniejącym lodzie do 2 h); natychmiast schłodź do ok. 20 °C.

3. Inokulacja

   Do dwóch płytek 90 mm przenieś po 1 ml próbki ciekłej lub zawiesiny wyjściowej (przy małej spodziewanej liczbie — 10 ml, granica 10× niżej); do kolejnej płytki 1 ml rozcieńczenia 10⁻¹ (ciecz) lub 10⁻² (inne produkty); powtórz z dalszymi rozcieńczeniami nową pipetą, wybierając co najmniej dwa kolejne krytyczne stopnie.

4. Posiew wgłębny i warstwa przykrywająca

   Wlej 12–15 ml (90 mm) lub 30–35 ml (140 mm) agaru TSC utemperowanego do 44–47 °C, wymieszaj ruchem obrotowym i pozostaw do zestalenia; następnie nałóż ok. 5 ml (90 mm) lub 12 ml (140 mm) agaru TSC jako warstwę przykrywającą.

5. Inkubacja beztlenowa

   Odwróć płytki i inkubuj w atmosferze beztlenowej w 37 °C przez 20 h ± 2 h.

6. Liczenie kolonii typowych

   W ciągu 30 min od wyjęcia z atmosfery beztlenowej policz kolonie czarne lub szare do żółtobrązowych na płytkach z < 150 kolonii przypuszczalnych.

7. Potwierdzenie

   Z każdej płytki wybierz 5 kolonii, posiej na agar z krwią (lub odżywczy) i inkubuj beztlenowo 37 °C 20 h ± 2 h (odczyt zaraz po inkubacji; płytki można chłodzić w 5 °C do 48 h). Wykonaj test fosfatazy kwaśnej (purpurowe zabarwienie w 3–4 min = dodatni) i test SIM (22 h ± 2 h, 37 °C).

8. Wynik

   Oblicz liczbę potwierdzonych C. perfringens na g lub ml próbki; w razie potrzeby zastosuj metodę z załącznika D do różnicowania szczepów patogennych dla człowieka.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• C. perfringens wytwarza toksyny i jest przyczyną zatruć pokarmowych — praca aseptyczna, autoklawowanie hodowli
• Łaźnia 80 °C i stopiony agar 44–47 °C — ryzyko poparzenia
• Systemy beztlenowe (generatory gazu, katalizatory) — stosować wg instrukcji producenta
• D-cykloseryna (antybiotyk) w podłożu — unikać wdychania i kontaktu ze skórą przy przygotowaniu

Najczęstsze pytania