🦠 Przetrwalniki beztlenowców redukujących siarczyny (clostridia) w wodzie — filtracja membranowa
Krótko: o co chodzi
Próbkę wody ogrzewa się 15 min w (75 ± 5) °C w celu zabicia form wegetatywnych, filtruje przez membranę 0,2 µm, membranę zalewa agarem siarczynowo-żelazowym i inkubuje beztlenowo w (37 ± 1) °C; czarne kolonie liczy się po (20 ± 4) h i (44 ± 4) h. Badanie wykonuje się według normy PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986); Selekcja przetrwalników: ogrzewanie (75 ± 5) °C przez 15 min od osiągnięcia temperatury; kontrola butelką z termometrem. Procedura obejmuje 6 kroków; stosuje się je m.in. do: Badanie naturalnych wód mineralnych, źródlanych i stołowych przy ujęciu i w opakowaniach (wymóg 0 w 50 ml wg rozporządzenia MZ z 2011 r.), Wody do picia, ze studni i źródeł, wody powierzchniowe słabo zanieczyszczone — objętość 100 ml, Ocena skuteczności uzdatniania i chlorowania (przetrwalniki jako wskaźnik odległego lub okresowego zanieczyszczenia).
W skrócie
- Norma: PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986)
- Kategoria: Mikrobiologia
- Kroków procedury: 6
- Selekcja przetrwalników: ogrzewanie (75 ± 5) °C przez 15 min od osiągnięcia temperatury; kontrola butelką z termometrem
- Filtr: jałowa membrana o nominalnej średnicy porów 0,2 µm; jakość wg ISO 7704
- Objętość: 100 ml (wody do picia, źródlane, studzienne, mineralne, morskie, powierzchniowe); < 10 ml mieszać z 10–100 ml jałowej wody
Przegląd
Przetrwalniki beztlenowców redukujących siarczyny (clostridia) są szeroko rozpowszechnione w środowisku: występują w kale ludzi i zwierząt, w ściekach i w glebie. W odróżnieniu od Escherichia coli i innych bakterii grupy coli przetrwalniki przeżywają w wodzie długo, bo są odporniejsze od form wegetatywnych na czynniki chemiczne i fizyczne — mogą więc wskazywać na odległe lub okresowe zanieczyszczenie; bywają odporne nawet na chlorowanie w dawkach stosowanych w uzdatnianiu i dlatego są przydatne do celów kontrolnych. ISO 6461/2-1986 (w Polsce PN-EN 26461-2:2001) określa metodę wykrywania i oznaczania ilościowego przetrwalników clostridiów przez filtrację membranową; stosuje się ją do wszystkich rodzajów wody, z wyjątkiem próbek, w których duża ilość cząstek zatrzymywałaby się na membranie. Clostridia definiuje się jako redukujące siarczyny, przetrwalnikujące, beztlenowe mikroorganizmy z rodziny Bacillaceae i rodzaju Clostridium. W Polsce rozporządzenie Ministra Zdrowia z 31 marca 2011 r. w sprawie naturalnych wód mineralnych, wód źródlanych i wód stołowych (Dz.U. 2011 nr 85 poz. 466) wymaga wykluczenia obecności clostridiów redukujących siarczyny (łącznie z przetrwalnikami) w 50 ml wody przy ujęciu; laboratoria stosują tę normę w badaniach wód butelkowanych (zestawienia podłoży: agar siarczynowy wg PN-EN 26461-2:2001).
Zasada metody
Wykrycie przetrwalników w określonej objętości wody wymaga trzech etapów: selekcji przetrwalników przez ogrzanie próbki na czas wystarczający do zniszczenia bakterii wegetatywnych; filtracji przez membranę o porach zatrzymujących przetrwalniki (0,2 µm); umieszczenia filtra na wybiórczym podłożu (agar siarczynowo-żelazowy) i inkubacji w (37 ± 1) °C przez (20 ± 4) h i (44 ± 4) h z liczeniem czarnych kolonii. Podłoże podstawowe to agar odżywczy (ekstrakt mięsny, pepton 10 g, NaCl 5 g, agar, woda 1000 ml; pH 7,6 ± 0,1 nastawione 1 mol/l NaOH; sterylizacja 20 min w (121 ± 1) °C; rozlewane po 18 ml do probówek, przechowywane w 4–5 °C i wyrzucane po 2 tygodniach); bezpośrednio przed użyciem do 18 ml roztopionego podłoża dodaje się 1 ml roztworu siarczynu sodu (10 g/100 ml, świeży co 2 tygodnie) i 5 kropli roztworu siarczanu żelaza(II) (8 g/100 ml). Alternatywą jest agar tryptozowo-siarczynowy (tryptoza 15 g, soyton 5 g, ekstrakt drożdżowy 5 g, pirosiarczyn sodu, cytrynian amonowo-żelazowy(III) 1 g). Odczyn podłoży mierzy się pH-metrem w odniesieniu do 25 °C, a jakość filtrów kontroluje wg ISO 7704, bo bywa różna między markami i partiami.
Zastosowania
- Badanie naturalnych wód mineralnych, źródlanych i stołowych przy ujęciu i w opakowaniach (wymóg 0 w 50 ml wg rozporządzenia MZ z 2011 r.)
- Wody do picia, ze studni i źródeł, wody powierzchniowe słabo zanieczyszczone — objętość 100 ml
- Ocena skuteczności uzdatniania i chlorowania (przetrwalniki jako wskaźnik odległego lub okresowego zanieczyszczenia)
- Ścieki i wody silnie zanieczyszczone — mniejsze objętości filtrowane po wymieszaniu z jałową wodą
- Wskaźnik towarzyszący Clostridium perfringens (PN-EN ISO 14189) w monitoringu wód
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Selekcja przetrwalników | ogrzewanie (75 ± 5) °C przez 15 min od osiągnięcia temperatury; kontrola butelką z termometrem |
| Filtr | jałowa membrana o nominalnej średnicy porów 0,2 µm; jakość wg ISO 7704 |
| Objętość | 100 ml (wody do picia, źródlane, studzienne, mineralne, morskie, powierzchniowe); < 10 ml mieszać z 10–100 ml jałowej wody |
| Podłoże | agar siarczynowo-żelazowy (18 ml podłoża + 1 ml Na₂SO₃ 10 % + 5 kropli FeSO₄ 8 %), pH 7,6 ± 0,1; alternatywnie agar tryptozowo-siarczynowy |
| Inkubacja | (37 ± 1) °C beztlenowo; odczyt po (20 ± 4) h i (44 ± 4) h |
| Wynik | czarne kolonie na objętość próbki; raportowany odczyt po 44 h (20 h tylko jako przybliżony) |
| Wymóg (wody mineralne, PL) | brak clostridiów redukujących siarczyny (z przetrwalnikami) w 50 ml |
Norma
- Numer normy
- PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986)
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe przetrwalników beztlenowców redukujących siarczyny (clostridia) — Część 2: Metoda filtracji membranowej
- Title (EN)
- Water quality — Detection and enumeration of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia) — Part 2: Method by membrane filtration
Procedura krok po kroku
-
Pobór i przygotowanie
Pobierz próbki wg ISO 5667-2 i ISO 8199; przechowuj wg ISO 5667-3.
-
Selekcja przetrwalników
Ogrzej próbkę w łaźni wodnej w (75 ± 5) °C przez 15 min liczone od chwili osiągnięcia tej temperatury; okresowo używaj butelki kontrolnej z tą samą objętością wody i termometrem do sprawdzenia czasu nagrzewania.
-
Filtracja
Wg ISO 7704 przefiltruj odpowiednią objętość: 100 ml dla wody do picia, źródlanej, studziennej, mineralnej, morskiej i słabo zanieczyszczonej powierzchniowej; dla wód silnie zanieczyszczonych i ścieków mniej (objętości < 10 ml wymieszaj z 10–100 ml jałowej wody). Dobierz rozcieńczenia tak, by kolonie były dobrze rozdzielone.
-
Zalanie membrany podłożem
Jałową pęsetą przenieś membranę stroną filtrującą do dołu na dno płytki Petriego bez pęcherzyków powietrza; przytrzymując ją, ostrożnie zalej 18 ml roztopionego kompletnego podłoża (z siarczynem i siarczanem żelaza) ostudzonego do ok. 50 °C i pozostaw do zestalenia.
-
Inkubacja
Inkubuj beztlenowo (lub w innych warunkach zapewniających beztlenowość) w (37 ± 1) °C przez (20 ± 4) h i (44 ± 4) h; w słoju lub cieplarce beztlenowej membranę można położyć na powierzchni agaru stroną filtrującą do góry.
-
Odczyt i sprawozdanie
Policz wszystkie czarne kolonie po (20 ± 4) h i (44 ± 4) h; wynik wyraź wg ISO 8199 jako liczbę beztlenowców redukujących siarczyny (clostridia) na objętość próbki — zwykle odczyt po 44 h, a odczyt po 20 h tylko jako przybliżony; opisz odstępstwa i zdarzenia mogące wpłynąć na wynik.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Zestaw do filtracji membranowej | lejek, podstawa, pompa próżniowa | — |
| Łaźnia wodna (75 ± 5) °C z termometrem | butelka kontrolna o tej samej objętości do sprawdzenia czasu nagrzewania | — |
| Cieplarka (37 ± 1) °C i układ beztlenowy | słój beztlenowy lub cieplarka beztlenowa (wtedy filtr może leżeć na powierzchni agaru do góry) | — |
| Autoklaw, parownik, pH-metr | sterylizacja podłoży (121 ± 1) °C; pH w 25 °C | — |
| Probówki 160 × 16 mm, pipety 10 ml (podziałka 0,1 ml), kolby 2 l, słoje 1 l, płytki Petriego, jałowe pęsety | — |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Agar odżywczy (ekstrakt mięsny, pepton 10 g, NaCl 5 g, agar, woda do 1 l), pH 7,6 ± 0,1 | — | |
| Siarczyn sodu Na₂SO₃ — 10 g w 100 ml wody (świeży co 2 tygodnie) | — | |
| Siarczan żelaza(II) FeSO₄ — 8 g krystalicznego w 100 ml wody | — | |
| Agar tryptozowo-siarczynowy (tryptoza 15 g, soyton 5 g, ekstrakt drożdżowy 5 g, pirosiarczyn sodu, cytrynian amonowo-żelazowy(III) 1 g/l) | — | |
| Wodorotlenek sodu 1 mol/l | — | |
| Woda destylowana lub dejonizowana bez substancji hamujących (ISO 3696) | — |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Hodowle beztlenowców z rodzaju Clostridium (w tym potencjalnie C. perfringens) — praca w laboratorium mikrobiologicznym, autoklawowanie odpadów
- Gorąca łaźnia wodna i roztopiony agar ok. 50 °C — ostrożnie przy zalewaniu membrany
- Słoje beztlenowe z generatorami gazów — postępuj według instrukcji producenta
Najczęstsze pytania
Jaka norma opisuje to badanie?
Badanie wykonuje się według normy PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986) — „Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe przetrwalników beztlenowców redukujących siarczyny (clostridia) — Część 2: Metoda filtracji membranowej”. Tytuł angielski: „Water quality — Detection and enumeration of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia) — Part 2: Method by membrane filtration”.
Na czym polega ta metoda?
Wykrycie przetrwalników w określonej objętości wody wymaga trzech etapów: selekcji przetrwalników przez ogrzanie próbki na czas wystarczający do zniszczenia bakterii wegetatywnych; filtracji przez membranę o porach zatrzymujących przetrwalniki (0,2 µm); umieszczenia filtra na wybiórczym podłożu (agar siarczynowo-żelazowy) i inkubacji w (37 ± 1) °C przez (20 ± 4) h i (44 ± 4) h z liczeniem czarnych kolonii. Podłoże podstawowe to agar odżywczy (ekstrakt mięsny, pepton 10 g, NaCl 5 g, agar, woda 1000 ml; pH 7,6 ± 0,1 nastawione 1 mol/l NaOH; sterylizacja 20 min w (121 ± 1) °C; rozlewane po 18 ml do probówek, przechowywane w 4–5 °C i wyrzucane po 2 tygodniach); bezpośrednio przed użyciem do 18 ml roztopionego podłoża dodaje się 1 ml roztworu siarczynu sodu (10 g/100 ml, świeży co 2 tygodnie) i 5 kropli roztworu siarczanu żelaza(II) (8 g/100 ml).
Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?
Selekcja przetrwalników: ogrzewanie (75 ± 5) °C przez 15 min od osiągnięcia temperatury; kontrola butelką z termometrem; Filtr: jałowa membrana o nominalnej średnicy porów 0,2 µm; jakość wg ISO 7704; Objętość: 100 ml (wody do picia, źródlane, studzienne, mineralne, morskie, powierzchniowe); < 10 ml mieszać z 10–100 ml jałowej wody; Podłoże: agar siarczynowo-żelazowy (18 ml podłoża + 1 ml Na₂SO₃ 10 % + 5 kropli FeSO₄ 8 %), pH 7,6 ± 0,1; alternatywnie agar tryptozowo-siarczynowy.
Ile trwa wykonanie badania?
Procedura obejmuje 6 kroków. Norma nie podaje czasu trwania dla wszystkich etapów — decyduje procedura laboratorium.
Jaki sprzęt jest potrzebny?
Zestaw do filtracji membranowej, Łaźnia wodna (75 ± 5) °C z termometrem, Cieplarka (37 ± 1) °C i układ beztlenowy, Autoklaw, parownik, pH-metr, Probówki 160 × 16 mm, pipety 10 ml (podziałka 0,1 ml), kolby 2 l, słoje 1 l, płytki Petriego, jałowe pęsety.
Gdzie stosuje się to badanie?
Badanie naturalnych wód mineralnych, źródlanych i stołowych przy ujęciu i w opakowaniach (wymóg 0 w 50 ml wg rozporządzenia MZ z 2011 r.); Wody do picia, ze studni i źródeł, wody powierzchniowe słabo zanieczyszczone — objętość 100 ml; Ocena skuteczności uzdatniania i chlorowania (przetrwalniki jako wskaźnik odległego lub okresowego zanieczyszczenia); Ścieki i wody silnie zanieczyszczone — mniejsze objętości filtrowane po wymieszaniu z jałową wodą; Wskaźnik towarzyszący Clostridium perfringens (PN-EN ISO 14189) w monitoringu wód.
Jakie środki ostrożności obowiązują?
Hodowle beztlenowców z rodzaju Clostridium (w tym potencjalnie C. perfringens) — praca w laboratorium mikrobiologicznym, autoklawowanie odpadów; Gorąca łaźnia wodna i roztopiony agar ok. 50 °C — ostrożnie przy zalewaniu membrany; Słoje beztlenowe z generatorami gazów — postępuj według instrukcji producenta.
Które laboratorium wykona to badanie?
Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN 26461-2.