🌿 Chlorofil a w wodzie
Spektrofotometryczne oznaczanie chlorofilu a w wodach powierzchniowych po ekstrakcji acetonowej i filtracji. Kluczowy wskaźnik eutrofizacji zbiorników wodnych i trofii wód.
Przegląd
Chlorofil a jest głównym barwnikiem fotosyntetycznym występującym we wszystkich organizmach fotoautotroficznych — glonach, sinicach i roślinach wodnych. Jego stężenie w wodzie jest powszechnie stosowanym wskaźnikiem biomasy fitoplanktonu i stopnia eutrofizacji zbiorników wodnych. Klasyfikacja troficzna wód opiera się w dużej mierze na stężeniu chlorofilu a: wody oligotroficzne (<2,5 µg/L), mezotroficzne (2,5–8 µg/L), eutroficzne (8–25 µg/L) i hipereutroficzne (>25 µg/L).
Metoda spektrofotometryczna wg PN-ISO 10260 polega na zagęszczeniu fitoplanktonu na sączku z włókna szklanego (GF/C lub GF/F), ekstrakcji barwników acetonem (90%) i pomiarze absorbancji przy 665 nm (maksimum absorpcji chlorofilu a) z korekcją na turbidimetrię przy 750 nm. Zakwaszenie ekstraktu HCl pozwala odróżnić aktywny chlorofil a od jego produktów degradacji (feofityna a).
Monitoring chlorofilu a jest wymagany przez Ramową Dyrektywę Wodną (2000/60/WE) jako element biologicznej oceny stanu wód powierzchniowych. W Polsce parametr ten jest obligatoryjny w ocenie stanu ekologicznego jezior i zbiorników zaporowych (Dz.U. 2019 poz. 2149).
Alternatywnie chlorofil a można oznaczać fluorescencyjnie (czulsze, LOD ~0,1 µg/L) lub chromatograficznie (HPLC — rozdzielenie poszczególnych barwników). Metoda spektrofotometryczna pozostaje jednak metodą referencyjną ze względu na prostotę i niski koszt.
Zasada metody
Fitoplankton z określonej objętości wody (0,5–2 L) jest zagęszczany na sączku z włókna szklanego (GF/C, porowatość 1,2 µm lub GF/F, 0,7 µm) metodą filtracji próżniowej. Sączek z osadem jest homogenizowany w 90% acetonie i ekstrahowany w ciemności w 4°C przez 12–24 godzin. Ekstrakt jest klarowany przez wirowanie (500 g, 20 min). Absorbancja jest mierzona przy 665 nm (chlorofil a) i 750 nm (korekcja na turbidimetrię). Następnie ekstrakt jest zakwaszany 0,1 M HCl (0,1 mL na 10 mL ekstraktu) i po 90 sekundach ponownie mierzona jest absorbancja przy 665 i 750 nm. Różnica absorbancji przed i po zakwaszeniu pozwala obliczyć stężenie aktywnego chlorofilu a i feofityny a. Obliczenia: Chl a [µg/L] = 26,7 × (A665₀ - A665a) × V_ekstrakt / (V_próbki × l), gdzie l — droga optyczna.
Zastosowania
- Monitoring eutrofizacji jezior i zbiorników zaporowych (RDW 2000/60/WE)
- Klasyfikacja troficzna wód powierzchniowych (oligotroficzne → hipereutroficzne)
- Ocena stanu ekologicznego wód — element biologiczny (Dz.U. 2019 poz. 2149)
- Monitoring zakwitów glonów i sinic (ryzyko toksyn)
- Kontrola jakości wody w ujęciach powierzchniowych
- Badania limnologiczne i oceanograficzne
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Długość fali pomiaru | 665 nm (chlorofil a), 750 nm (korekcja tła) |
| Zakres pomiarowy | 0,5–500 µg/L (z dostosowaniem objętości filtracji) |
| Granica oznaczalności (LOQ) | 0,5–1,0 µg/L |
| Rozpuszczalnik ekstrakcyjny | 90% aceton wodny |
| Czas ekstrakcji | 12–24 godzin w 4°C, ciemność |
| Klasyfikacja troficzna | <2,5 µg/L oligo | 2,5–8 mezo | 8–25 eu | >25 hiper |
Norma
- Numer normy
- PN-ISO 10260:2002
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Pomiar parametrów biochemicznych — Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia chlorofilu a
- Title (EN)
- Water quality — Measurement of biochemical parameters — Spectrometric determination of the chlorophyll a concentration
Procedura krok po kroku
1. Pobranie próbki wody
Pobierz reprezentatywną próbkę wody (1–5 L) z ustalonej głębokości. Przechowuj w ciemności, w 4°C. Filtruj w ciągu 4 godzin od pobrania.
2. Filtracja
Umieść sączek GF/C (47 mm) na aparacie do filtracji próżniowej. Dodaj szczyptę MgCO₃ na sączek. Filtruj odmierzoną objętość próbki (0,5–2 L) pod próżnią (<0,3 bar).
3. Ekstrakcja acetonowa
Przenieś sączek z osadem do probówki wirówkowej. Dodaj 10 mL 90% acetonu. Zhomogenizuj sączek Ultra-Turraxem (30 s). Zamknij, owiń folią aluminiową.
4. Inkubacja w ciemności
Umieść probówki w lodówce (4°C) na 12–24 godzin w ciemności. Aceton penetruje komórki i ekstrahuje barwniki.
5. Klarowanie ekstraktu
Wiruj ekstrakt (500 g, 20 min) lub filtruj przez sączek GF/F. Przenieś klarowny ekstrakt do czystej fiolki.
6. Pomiar absorbancji (przed zakwaszeniem)
Zmierz absorbancję przy 665 nm i 750 nm względem 90% acetonu (blank). Zapisz wartości A665₀ i A750₀.
7. Zakwaszenie HCl
Dodaj 0,1 mL 0,1 M HCl do kuwety z 10 mL ekstraktu. Delikatnie wymieszaj odwracaniem. Odczekaj dokładnie 90 sekund.
8. Pomiar absorbancji (po zakwaszeniu)
Zmierz absorbancję przy 665 nm i 750 nm. Zapisz wartości A665a i A750a. Zakwaszenie konwertuje chlorofil → feofitynę.
9. Obliczenia
Chl a [µg/L] = 26,7 × [(A665₀ - A750₀) - (A665a - A750a)] × V_ekstrakt [mL] / (V_próbki [L] × l [cm]). Feofityna a = 26,7 × [1,7 × (A665a - A750a) - (A665₀ - A750₀)] × V_e / (V_p × l).
10. Kontrola jakości
Standard chlorofilu a w acetonie (znane stężenie) — odzysk 90–110%. Blank acetonu A665 < 0,005. Duplikat: CV < 15%.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Spektrofotometr UV-Vis | Shimadzu UV-1900i, Hach DR 6000, Agilent Cary 60, Thermo Evolution 201 | 15 000–80 000 PLN |
| Aparat do filtracji próżniowej | Sartorius, Millipore, lejek 47 mm + kolba ssawkowa + pompa membranowa | 2 000–5 000 PLN |
| Sączki z włókna szklanego GF/C | Whatman GF/C 47 mm (1,2 µm) lub GF/F (0,7 µm) | 1–3 PLN/szt. |
| Wirówka laboratoryjna | Eppendorf 5804R, Hettich Universal 320R, min. 500 g | 10 000–40 000 PLN |
| Homogenizator tkankowy | IKA T10 basic Ultra-Turrax, szklany homogenizator Potter | 3 000–8 000 PLN |
| Lodówka laboratoryjna (4°C) | Liebherr LKPv 6520, POL-EKO CHL 700 | 5 000–15 000 PLN |
| Kuwety szklane 1–5 cm | Hellma, Starna, optyczne borokrzem | 100–500 PLN/szt. |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Aceton (C₃H₆O) 90% | 67-64-1 | Cz.d.a., 900 mL acetonu + 100 mL wody dejonizowanej, rozpuszczalnik ekstrakcyjny |
| Kwas solny (HCl) 0,1 M | 7647-01-0 | Do zakwaszania ekstraktu — rozróżnienie chlorofilu a i feofityny a |
| Węglan magnezu (MgCO₃) | 546-93-0 | Dodatek na sączek przed filtracją — zapobiega degradacji chlorofilu |
| Standard chlorofilu a | 479-61-8 | Czysty chlorofil a z Anacystis nidulans lub szpinaku, do kalibracji, Sigma-Aldrich C6144 |
| Woda dejonizowana | — | Do przygotowania 90% acetonu i płukania |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Aceton — łatwopalny (Tзапал. -20°C), pary tworzą mieszaniny wybuchowe, praca pod dygestorium!
- Kwas solny — żrący, opary drażniące, stosować w wentylowanym miejscu
- Próbki wody — potencjalnie zawierają toksyny sinicowe (mikrocystyny), rękawice
- Okulary ochronne, fartuch i rękawice nitrylowe obowiązkowe
- Odpady acetonowe zbierać do pojemnika na odpady organiczne łatwopalne