🦠 Campylobacter spp. w żywności — oznaczanie liczby na agarze mCCD w atmosferze mikroaerofilnej, 41,5 °C
Krótko: o co chodzi
0,1 ml zawiesiny wyjściowej (lub 1 ml na dużą płytkę dla niskich liczb) i rozcieńczeń posiewa się powierzchniowo na zmodyfikowany agar z węglem, cefoperazonem i dezoksycholanem (mCCDA), inkubuje 44 h ± 4 h w 41,5 °C w atmosferze mikroaerofilnej (5 % O₂, 10 % CO₂) i liczy szarawe, płaskie, wilgotne kolonie z metalicznym połyskiem po potwierdzeniu (morfologia i ruch, oksydaza, brak wzrostu tlenowego w 25 °C); metoda referencyjna kryterium 1000 jtk/g dla tusz brojlerów. Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023); Podłoże: zmodyfikowany agar z węglem, cefoperazonem i dezoksycholanem (mCCDA); skład i badanie wykonania — załącznik B. Procedura obejmuje 6 kroków; stosuje się je m.in. do: Kryterium higieny procesu dla tusz brojlerów po schłodzeniu (skóra szyi) — 1000 jtk/g, metoda referencyjna EN ISO 10272-2 (rozp. 2073/2005 poz. 2.1.9), Mięso drobiowe i inne surowe mięso, mleko surowe, Próbki z produkcji pierwotnej — kał, kurz, wymazy w fermach drobiu (bioasekuracja).
W skrócie
- Norma: PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023)
- Kategoria: Mikrobiologia
- Kroków procedury: 6
- Podłoże: zmodyfikowany agar z węglem, cefoperazonem i dezoksycholanem (mCCDA); skład i badanie wykonania — załącznik B
- Inkubacja: 41,5 °C ± 1 °C, 44 h ± 4 h, atmosfera mikroaerofilna (O₂ 5 ± 2 %, CO₂ 10 ± 3 %, opcjonalnie H₂ ≤ 10 %, reszta N₂)
- Inokulum: 0,1 ml na płytkę 90 mm; 1,0 ml na płytkę 140 mm lub 3 × 90 mm (duplikaty) dla niskich liczb
Przegląd
ISO 10272-2:2017 określa horyzontalną metodę oznaczania liczby Campylobacter spp. w produktach dla ludzi i zwierząt, próbkach środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością i paszami oraz próbkach z produkcji pierwotnej (kał zwierząt, kurz, wymazy). Pierwsze wydanie zastąpiło ISO/TS 10272-2:2006; zmiany (uznane za drobne): dodanie próbek z produkcji pierwotnej, posiew rozcieńczeń pojedynczo zamiast w duplikacie (zgodnie z ISO 7218), zastąpienie testów wzrostu mikroaerofilnego w 25 °C i tlenowego w 41,5 °C badaniem wzrostu tlenowego w 25 °C, dodanie badania wykonania podłoży (załącznik B) i charakterystyk metody (załącznik C). Poprawka Amd 1:2023 wprowadziła metody molekularne potwierdzania i identyfikacji termotolerancyjnych Campylobacter oraz zmiany w badaniu wykonania podłoży. Campylobacter definiuje się jako mikroorganizmy tworzące charakterystyczne kolonie na stałych podłożach selektywnych w atmosferze mikroaerofilnej w 41,5 °C, o charakterystycznej morfologii, ruchu oraz cechach biochemicznych i wzrostowych; norma dotyczy gatunków termotolerancyjnych istotnych dla zdrowia — najczęściej C. jejuni i C. coli, także C. lari, C. upsaliensis. Rozporządzenie (WE) 2073/2005 (kryterium higieny procesu 2.1.9) wskazuje EN ISO 10272-2 jako metodę referencyjną dla Campylobacter spp. w tuszach brojlerów po schłodzeniu: limit 1000 jtk/g, n = 50, c = 10 od 1.1.2025 (wcześniej 20, potem 15); przy niezgodności — poprawa higieny uboju i bioasekuracji w gospodarstwach. Badania wolno prowadzić tylko w odpowiednio wyposażonych laboratoriach pod nadzorem mikrobiologa.
Zasada metody
Oznaczanie wymaga trzech kolejnych etapów (załącznik A): przygotowanie rozcieńczeń dziesiętnych wg ISO 6887 (pojedyncza seria); posiew na stałe podłoże selektywne — zmodyfikowany agar z węglem, cefoperazonem i dezoksycholanem (mCCD) — określonej ilości próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej oraz rozcieńczeń, inkubacja w 41,5 °C w atmosferze mikroaerofilnej i ocena po 44 h z zapisem liczby kolonii podejrzanych; potwierdzenie — badanie morfologii i ruchu pod mikroskopem, przesiew na nieselektywny agar z krwią, test oksydazy i badanie wzrostu tlenowego w 25 °C (opcjonalnie identyfikacja gatunku testami biochemicznymi i/lub molekularnymi). Posiewa się 0,1 ml zawiesiny na płytkę mCCDA, dla niskich liczb — 1,0 ml na płytkę 140 mm lub trzy płytki 90 mm (w duplikacie: dwie duże lub sześć zwykłych); jeśli używa się tylko zawiesiny wyjściowej, przygotowuje się duplikat. Inokulum rozprowadza się szybko jałową głaszczką; suszenie płytek jest krytyczne dla policzalności i każde laboratorium stosuje własny standaryzowany sposób. Atmosfera mikroaerofilna: 5 % ± 2 % O₂, 10 % ± 3 % CO₂, opcjonalnie ≤ 10 % H₂, reszta azot — w gazoszczelnych słojach z zestawami gazotwórczymi lub przez napełnienie słoja/cieplarki mieszaniną gazów. Typowe kolonie na mCCD są szarawe, często z metalicznym połyskiem, płaskie i wilgotne, ze skłonnością do rozpełzania (mniej na suchszym agarze); rozpoznawanie kolonii w dużym stopniu zależy od doświadczenia. Do testu oksydazy nie nadaje się eza niklowo-chromowa. Campylobacter jest bardzo wrażliwy na zamrażanie, a najlepiej przeżywa w niskich temperaturach — próbek nie zamrażać, przechowywać w 3 °C, badać jak najszybciej i chronić przed wysychaniem.
Zastosowania
- Kryterium higieny procesu dla tusz brojlerów po schłodzeniu (skóra szyi) — 1000 jtk/g, metoda referencyjna EN ISO 10272-2 (rozp. 2073/2005 poz. 2.1.9)
- Mięso drobiowe i inne surowe mięso, mleko surowe
- Próbki z produkcji pierwotnej — kał, kurz, wymazy w fermach drobiu (bioasekuracja)
- Próbki środowiskowe z ubojni i zakładów rozbioru
- Badania ilościowe w ocenie ryzyka i skuteczności interwencji (schładzanie, mycie tusz)
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Podłoże | zmodyfikowany agar z węglem, cefoperazonem i dezoksycholanem (mCCDA); skład i badanie wykonania — załącznik B |
| Inkubacja | 41,5 °C ± 1 °C, 44 h ± 4 h, atmosfera mikroaerofilna (O₂ 5 ± 2 %, CO₂ 10 ± 3 %, opcjonalnie H₂ ≤ 10 %, reszta N₂) |
| Inokulum | 0,1 ml na płytkę 90 mm; 1,0 ml na płytkę 140 mm lub 3 × 90 mm (duplikaty) dla niskich liczb |
| Potwierdzenie | morfologia i ruch (mikroskop, najlepiej kontrast fazowy), przesiew na agar z krwią, oksydaza +, brak wzrostu tlenowego w 25 °C; opcjonalnie identyfikacja gatunku (biochemia, PCR — Amd 1:2023) |
| Kryterium prawne | tusze brojlerów: 1000 jtk/g, n = 50, c = 10 (od 1.1.2025) |
| Przechowywanie próbek | bez zamrażania, 3 °C ± 2 °C, analiza jak najszybciej, ochrona przed wysychaniem |
| Wynik | jtk/g, jtk/ml, jtk/cm² lub na urządzenie do pobierania próbek |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023)
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Campylobacter spp. — Część 2: Metoda liczenia kolonii
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique
Procedura krok po kroku
-
Próbka
Pobierz wg ISO/TS 17728 (żywność), ISO 13307 (produkcja pierwotna), ISO 17604 (tusze) lub ISO 18593 (powierzchnie); nie zamrażaj, przechowuj w 3 °C, badaj szybko. Przygotuj zawiesinę wyjściową i pojedynczą serię rozcieńczeń dziesiętnych wg ISO 6887.
-
Posiew
Przenieś 0,1 ml zawiesiny wyjściowej (lub próbki płynnej) i kolejnych rozcieńczeń na płytki mCCDA; dla niskich liczb — 1,0 ml na płytkę 140 mm lub trzy płytki 90 mm, w duplikacie; przy samej zawiesinie wyjściowej przygotuj duplikat. Rozprowadź szybko jałową głaszczką, nie dotykając brzegów; płytki wysusz w standaryzowany sposób.
-
Inkubacja mikroaerofilna
Umieść płytki w słoju z zestawem gazotwórczym (ściśle wg instrukcji producenta) lub w cieplarce z mieszaniną gazów i inkubuj 44 h ± 4 h w 41,5 °C.
-
Liczenie kolonii podejrzanych
Zapisz liczbę kolonii typowych/podejrzanych: szarawe, często z metalicznym połyskiem, płaskie i wilgotne, rozpełzające się; inne formy możliwe.
-
Potwierdzenie
Wybrane kolonie obejrzyj pod mikroskopem (morfologia, ruch), przesiej na agar z krwią, wykonaj test oksydazy (eza inna niż Ni-Cr) i badanie wzrostu tlenowego w 25 °C (Campylobacter nie rośnie); opcjonalnie zidentyfikuj gatunek testami biochemicznymi lub molekularnymi.
-
Wynik
Z liczby potwierdzonych kolonii typowych na płytkę oblicz liczbę Campylobacter w jtk/g, ml, cm² lub na urządzenie do pobierania; porównaj z kryterium 1000 jtk/g dla tusz brojlerów.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Cieplarki 25 °C ± 1 °C, 37 °C ± 1 °C i 41,5 °C ± 1 °C | wzrost tlenowy w 25 °C — test potwierdzający | — |
| Gazoszczelne słoje z zestawami gazotwórczymi lub cieplarka z mieszaniną gazów | atmosfera mikroaerofilna 5 % O₂, 10 % CO₂ | — |
| Mikroskop z kontrastem fazowym | morfologia i ruch Campylobacter | — |
| Jałowe płytki Petriego 90 mm i opcjonalnie 140 mm (najlepiej z wentylacją) | — | |
| Ezy 10 µl i 1 µl (nie Ni-Cr do oksydazy), igła posiewowa, łaźnia wodna 37 °C ± 1 °C, lodówki 3 °C ± 2 °C i 5 °C ± 3 °C | — |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Agar mCCD (zmodyfikowany agar z węglem, cefoperazonem i dezoksycholanem) — podłoże podstawowe z suplementem antybiotykowym (załącznik B) | — | |
| Agar z krwią (nieselektywny) | — | |
| Odczynnik do testu oksydazy | — | |
| Rozcieńczalniki wg ISO 6887 | — | |
| Szczepy kontrolne i zestawy do identyfikacji biochemicznej/molekularnej (opcjonalnie) | — |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Campylobacter jest patogenem człowieka — badania tylko w odpowiednio wyposażonych laboratoriach pod nadzorem mikrobiologa, staranna utylizacja materiałów po inkubacji
- Zestawy gazotwórcze i mieszaniny z wodorem (≤ 10 %) — postępowanie wg instrukcji producenta, słoje gazoszczelne
- Cefoperazon i inne antybiotyki w suplementach — unikać pylenia i kontaktu
Najczęstsze pytania
Jaka norma opisuje to badanie?
Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023) — „Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Campylobacter spp. — Część 2: Metoda liczenia kolonii”. Tytuł angielski: „Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique”.
Na czym polega ta metoda?
Oznaczanie wymaga trzech kolejnych etapów (załącznik A): przygotowanie rozcieńczeń dziesiętnych wg ISO 6887 (pojedyncza seria); posiew na stałe podłoże selektywne — zmodyfikowany agar z węglem, cefoperazonem i dezoksycholanem (mCCD) — określonej ilości próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej oraz rozcieńczeń, inkubacja w 41,5 °C w atmosferze mikroaerofilnej i ocena po 44 h z zapisem liczby kolonii podejrzanych; potwierdzenie — badanie morfologii i ruchu pod mikroskopem, przesiew na nieselektywny agar z krwią, test oksydazy i badanie wzrostu tlenowego w 25 °C (opcjonalnie identyfikacja gatunku testami biochemicznymi i/lub molekularnymi). Posiewa się 0,1 ml zawiesiny na płytkę mCCDA, dla niskich liczb — 1,0 ml na płytkę 140 mm lub trzy płytki 90 mm (w duplikacie: dwie duże lub sześć zwykłych); jeśli używa się tylko zawiesiny wyjściowej, przygotowuje się duplikat.
Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?
Podłoże: zmodyfikowany agar z węglem, cefoperazonem i dezoksycholanem (mCCDA); skład i badanie wykonania — załącznik B; Inkubacja: 41,5 °C ± 1 °C, 44 h ± 4 h, atmosfera mikroaerofilna (O₂ 5 ± 2 %, CO₂ 10 ± 3 %, opcjonalnie H₂ ≤ 10 %, reszta N₂); Inokulum: 0,1 ml na płytkę 90 mm; 1,0 ml na płytkę 140 mm lub 3 × 90 mm (duplikaty) dla niskich liczb; Potwierdzenie: morfologia i ruch (mikroskop, najlepiej kontrast fazowy), przesiew na agar z krwią, oksydaza +, brak wzrostu tlenowego w 25 °C; opcjonalnie identyfikacja gatunku (biochemia, PCR — Amd 1:2023).
Ile trwa wykonanie badania?
Procedura obejmuje 6 kroków. Norma nie podaje czasu trwania dla wszystkich etapów — decyduje procedura laboratorium.
Jaki sprzęt jest potrzebny?
Cieplarki 25 °C ± 1 °C, 37 °C ± 1 °C i 41,5 °C ± 1 °C, Gazoszczelne słoje z zestawami gazotwórczymi lub cieplarka z mieszaniną gazów, Mikroskop z kontrastem fazowym, Jałowe płytki Petriego 90 mm i opcjonalnie 140 mm (najlepiej z wentylacją), Ezy 10 µl i 1 µl (nie Ni-Cr do oksydazy), igła posiewowa, łaźnia wodna 37 °C ± 1 °C, lodówki 3 °C ± 2 °C i 5 °C ± 3 °C.
Gdzie stosuje się to badanie?
Kryterium higieny procesu dla tusz brojlerów po schłodzeniu (skóra szyi) — 1000 jtk/g, metoda referencyjna EN ISO 10272-2 (rozp. 2073/2005 poz. 2.1.9); Mięso drobiowe i inne surowe mięso, mleko surowe; Próbki z produkcji pierwotnej — kał, kurz, wymazy w fermach drobiu (bioasekuracja); Próbki środowiskowe z ubojni i zakładów rozbioru; Badania ilościowe w ocenie ryzyka i skuteczności interwencji (schładzanie, mycie tusz).
Jakie środki ostrożności obowiązują?
Campylobacter jest patogenem człowieka — badania tylko w odpowiednio wyposażonych laboratoriach pod nadzorem mikrobiologa, staranna utylizacja materiałów po inkubacji; Zestawy gazotwórcze i mieszaniny z wodorem (≤ 10 %) — postępowanie wg instrukcji producenta, słoje gazoszczelne; Cefoperazon i inne antybiotyki w suplementach — unikać pylenia i kontaktu.
Które laboratorium wykona to badanie?
Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 10272-2.