🔴 Campylobacter w żywności
Wykrywanie Campylobacter spp. w żywności i paszach metodą namnażania selektywnego w bulionie Boltona lub Prestona, izolacji na agarze mCCDA i potwierdzenia biochemicznego/molekularnego.
Przegląd
Campylobacter jest najczęstszą bakteryjną przyczyną zapalenia żołądkowo-jelitowego (kampilobakteriozy) w Unii Europejskiej — rocznie rejestruje się ponad 200 000 przypadków. Głównymi gatunkami chorobotwórczymi są C. jejuni (ok. 90% przypadków) i C. coli (ok. 10%). Źródłem zakażenia jest najczęściej mięso drobiowe (szczególnie kurczaki), niepasteryzowane mleko oraz skażona woda. Dawka zakaźna jest bardzo niska — wystarczy 500–800 komórek, aby wywołać chorobę.
Norma PN-EN ISO 10272-1 opisuje horyzontalną metodę wykrywania Campylobacter termofilnych w żywności, paszach i próbkach środowiskowych. Metoda obejmuje trzy procedury wykrywania, dostosowane do rodzaju próbki: Procedura A (bulion Boltona) — dla próbek z niską liczbą Campylobacter i niską mikroflorą towarzyszącą (żywność mrożona, gotowana); Procedura B (bulion Prestona) — dla próbek z niską liczbą Campylobacter, ale wysoką mikroflorą towarzyszącą (surowe mięso, surowe mleko); Procedura C — posiew bezpośredni dla próbek z wysoką liczbą Campylobacter.
Campylobacter to bakterie mikroaerofilne — wymagają atmosfery z obniżoną zawartością tlenu (5% O₂, 10% CO₂, 85% N₂) i podwyższonej temperatury inkubacji (41,5°C). Są wybredne wzrostowo, wrażliwe na tlen, wysuszenie i niskie pH, co czyni ich hodowlę wymagającą technicznie.
Badanie na obecność Campylobacter jest wymagane przez Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 dla tuszek kurcząt brojlerów. Kryterium higieny procesu wynosi 1000 jtk/g w tuszce po chłodzeniu. Jest to priorytetowy patogen w programach monitoringu bezpieczeństwa żywności.
Zasada metody
Metoda polega na selektywnym namnażaniu Campylobacter w bulionie Boltona (37°C/4–6 h, następnie 41,5°C/44 h) lub Prestona (41,5°C/24 h) w warunkach mikroaerofilnych. Antybiotyki w bulionach (cefoperazon, trimetoprym, wankomycyna, cykloheliksymid) hamują florę towarzyszącą. Po namnażaniu próbkę posiewamy na selektywne podłoże stałe — agar mCCDA (modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar) i drugie podłoże selektywne. Węgiel drzewny w mCCDA adsorbuje toksyczne metabolity. Kolonie Campylobacter są szare, płaskie, wilgotne, z metalicznym połyskiem i tendencją do rozpływania się. Potwierdzenie obejmuje testy biochemiczne (oksydaza+, katalaza+, brak wzrostu w 25°C) lub PCR.
Zastosowania
- Kontrola mięsa drobiowego — tuszki kurcząt brojlerów (Rozporządzenie (WE) 2073/2005)
- Badanie surowego mleka i niepasteryzowanych produktów mlecznych
- Monitoring linii produkcyjnych w ubojniach drobiu
- Kontrola wody pitnej i wody do celów spożywczych
- Badanie żywności gotowej do spożycia (RTE)
- Postępowanie epidemiologiczne w przypadku ognisk kampilobakteriozy
- Monitoring w programach kontroli Salmonella/Campylobacter w drobiu
- Kontrola próbek środowiskowych w zakładach mięsnych
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Temperatura namnażania | 37°C (4–6 h) → 41,5°C (44 h) — Procedura A / 41,5°C (24 h) — Procedura B |
| Atmosfera | Mikroaerofilna: 5% O₂, 10% CO₂, 85% N₂ |
| Bulion namnażania | Bolton Broth (Procedura A) lub Preston Broth (Procedura B) |
| Podłoże izolacyjne | mCCDA (modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar) |
| Typ kolonii | Szare, płaskie, wilgotne, metaliczny połysk, rozpływające się |
| Potwierdzenie | Oksydaza+, katalaza+, morfologia (spirale), brak wzrostu 25°C lub PCR |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 10272-1:2017
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Campylobacter spp. — Część 1: Metoda wykrywania
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 1: Detection method
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie próbki
Odważ 25 g (lub 10 g) próbki do woreczka stomachera. Dodaj 225 mL (lub 90 mL) bulionu Boltona z suplementem antybiotykowym i krwią lizowaną konia (5%).
2. Namnażanie — faza I (Procedura A)
Homogenizuj i inkubuj w atmosferze mikroaerofilnej: najpierw 37 ± 1°C przez 4–6 h (faza resuscytacji), następnie podnieś temperaturę do 41,5 ± 1°C.
3. Namnażanie — faza II
Kontynuuj inkubację w 41,5 ± 1°C w atmosferze mikroaerofilnej przez kolejne 44 ± 4 h (łącznie 48 h od rozpoczęcia).
4. Izolacja na mCCDA
Z namnożonego bulionu posiej eozę na płytkę mCCDA i drugie podłoże selektywne. Inkubuj w atmosferze mikroaerofilnej w 41,5 ± 1°C przez 44 ± 4 h.
5. Odczyt kolonii
Wyszukaj typowe kolonie Campylobacter — szare, płaskie, wilgotne, z metalicznym połyskiem i tendencją do rozpływania. Mogą być też kolonie punktowe, okrągłe, lśniące.
6. Przesiew na agar nieselektywny
Wybierz min. 1 typową kolonię z każdej płytki. Przesiej na agar Columbia z krwią baranią (5%). Inkubuj 24–48 h w 41,5°C w mikroaerobie.
7. Testy potwierdzenia
Wykonaj: test oksydazy (+), test katalazy (+), preparat mikroskopowy (spirale), test wzrostu w 25°C (brak wzrostu) i w warunkach tlenowych w 41,5°C (brak wzrostu). Lub potwierdź metodą PCR.
8. Interpretacja i raportowanie
Wynik raportuj jako: „Campylobacter spp. wykryto/nie wykryto w X g próbki". Jeśli wykonano identyfikację do gatunku — podaj: C. jejuni lub C. coli.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator z atmosferą mikroaerofilną | Binder CB 60/160 z kontrolą gazów, lub jary anaerobowe + generatory | 15 000–50 000 PLN |
| Generatory atmosfery mikroaerofilnej | Oxoid CampyGen, bioMérieux GENbag microaer, Anaerocult C | 200–500 PLN / 10 szt. |
| Jary anaerobowe (słoiki) | Oxoid AnaeroJar 2,5 L, Merck Anaerocult | 500–1 500 PLN |
| Komora laminarna klasy II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream AC2 | 25 000–60 000 PLN |
| Stomacher / homogenizator | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| Mikroskop optyczny | Olympus CX23, Zeiss Primo Star, Nikon Eclipse Si | 5 000–20 000 PLN |
| Autoklaw laboratoryjny | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Bolton Broth (bulion Boltona) | — | Bulion namnażania selektywnego: pepton mięsny, laktoza, pirogronian sodu, α-ketoglutaran, metabisiarczyn sodu, karbonian sodu; op. 500 g + suplementy antybiotykowe |
| Suplement Bolton (antybiotyki) | 62893-20-3 | Cefoperazon, trimetoprym, wankomycyna, cykloheliksymid; op. 10 fiolek |
| mCCDA Agar (modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar) | 302-95-4 | Węgiel drzewny, dezoksycholan sodu, siarczan żelazawy, pirogronian sodu, agar; op. 500 g |
| Suplement mCCDA (cefoperazon + amfoterycyna B) | 62893-20-3 | Antybiotyki selektywne, op. 10 fiolek |
| Krew lizowana konia (5%) | — | Dodatek do bulionu Boltona — czynnik wzrostu, neutralizacja inhibitorów; op. 100 mL |
| Odczynnik oksydazowy (Kovácsa) | — | Do testu potwierdzenia — Campylobacter oksydaza-dodatni; paski lub krople |
| Woda peptonowa buforowana (BPW) | — | Do przygotowania zawiesiny wyjściowej, op. 500 g |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Campylobacter — patogen BSL-2 o bardzo niskiej dawce zakaźnej (500 komórek), stosować pełne ŚOI
- Praca wyłącznie w komorze laminarnej klasy II — szczególna ostrożność przy otwieraniu jarów
- Atmosfera mikroaerofilna — generatory gazów mogą powodować miejscowy spadek O₂, wentylacja pomieszczenia
- Zużyte materiały autoklawować przed utylizacją (121°C/20 min)
- Antybiotyki w suplementach — unikać kontaktu ze skórą, stosować rękawice
- Dezynfekcja powierzchni 70% etanolem lub podchlorynem sodu 0,5%