🦠 Walidacja metod zatężania bakteriofagów z wody (gdy spodziewane jest mniej niż 3 cząstki tworzące łysinki w 1 ml) — materiał wzbogacający z oczyszczonego lub surowego ścieku (wirowanie 1000 g przez 20 min albo filtracja 8–12 µm, 60–200 pfp/ml, glicerol 5 %, porcje 10 ml zamrożone w −20 lub −70 °C) sprawdzany testami dyspersji T1 (0,01 < T1 < 5,99) i T2 (< 3,84); dla każdego rodzaju wody co najmniej pięć próbek w różne dni i pory roku, objętości 0,125, 0,25, 0,5 i 1 × Vmax wzbogacone 1 ml materiału, odzysk w całym końcowym koncentracie, test Dixona dla wartości odstających; liczenie fagów według ISO 10705-1, -2 lub -4; PN-EN ISO 10705-3:2025-06

Mikrobiologia PN-EN ISO 10705-3

Przegląd

CO TA NORMA OPISUJE. Tekst normy czytamy w próbce iTeh dokumentu ISO 10705-3:2003 (wydanie pierwsze z 01.10.2003, wersja francuska) — PN-EN ISO 10705-3:2025-06 wprowadza EN ISO 10705-3:2024 i ISO 10705-3:2003 jako identyczne (wyszukiwarka PKN), więc czytany tekst ISO jest tym, który obowiązuje: przedmowa, rozdziały 1–8 i rozdział 9 do końca punktu 9.2 — próbka kończy się na stronie 5. Obliczeń (10), kontroli jakości analitycznej (11), sprawozdania (12), załącznika A (zalecane metody zatężania zależnie od objętości, mętności i zawartości cząstek) i B (przykład walidacji) nie czytamy; tytuły znamy ze spisu treści. Strony tytułowej EN ISO 10705-3:2024 nie czytaliśmy.

WEDŁUG TEKSTU ISO 10705-3:2003. Normę przygotował ISO/TC 147 „Jakość wody”, podkomitet SC 4 „Metody mikrobiologiczne”. Seria ISO 10705: część 1 — bakteriofagi F-swoiste RNA, część 2 — colifagi somatyczne, część 3 — walidacja metod zatężania, część 4 — bakteriofagi infekujące Bacteroides fragilis. Ostrzeżenie: użytkownik ustala zasady bezpieczeństwa i higieny pracy; ważne: personel walidujący musi mieć doświadczenie w metodach liczenia bakteriofagów (ISO/TR 13843). Zakres (1): ogólne zasady oceny działania metod zatężania bakteriofagów z wody; zatężanie zaleca się dla próbek, w których spodziewa się mniej niż 3 cząstek tworzących łysinki (pfp) w mililitrze; metody można stosować do każdej wody, jeśli ilość i rodzaj zawiesin lub substancji rozpuszczonych nie zakłóca zatężania; norma nie podaje szczegółów metod, tylko zasady oceny przydatności metody dla danego rodzaju i objętości wody; przykłady metod uznanych za zadowalające — w załączniku A. Powołania (2): ISO 3696, ISO 6887-1, ISO 8199, ISO 10705-1, -2, -4, przewodnik ISO/IEC 2. Definicja (3.1): bakteriofagi — wirusy bakterii zdolne infekować wybrane szczepy gospodarza; uwaga: tworzą widoczne łysinki (strefy lizy) w zwartej murawie szczepu gospodarza. Zasada (4): próbkę traktuje się wybraną metodą, która zatęża bakteriofagi z dużej objętości (od 100 ml do kilku litrów) do małej (od kilku do 20 ml); koncentrat bada się metodą znormalizowaną lub innym odpowiednim protokołem; metodę zatężania opisuje się dokładnie w protokole (możliwie zgodnie z układem norm ISO) z docelowymi grupami fagów i metodami ich wykrywania, rodzajami wód, zakresem objętości i wyjątkami, np. mętnością; walidacja polega na wyznaczeniu odzysku bakteriofagów z serii próbek wzbogaconych wodą naturalnie zanieczyszczoną (surowym lub oczyszczonym ściekiem) w zakresie objętości, ze szczególną uwagą na powtarzalność odzysku. Odczynniki (5): składniki o stałej jakości i chemikalia analityczne; woda destylowana w szkle lub dejonizowana, bez substancji hamujących wzrost bakterii, co najmniej klasy 3 (ISO 3696); rozcieńczalnik — roztwór soli z peptonem lub inny według ISO 6887-1 lub ISO 8199; podłoża i szczepy odniesienia według właściwej metody liczenia fagów (ISO 10705-1, -2, -4); glicerol (870 g/l) autoklawowany w (121 ± 3) °C przez 15 min, w ciemności w temperaturze pokojowej najwyżej rok. Aparatura (6): środki ostrożności — sprzęt terenowy dezynfekuje się przed użyciem; niektóre etapy wymagają ciśnienia hydrostatycznego lub pneumatycznego; zwykły sprzęt mikrobiologiczny według metody liczenia i protokołu zatężania. Pobieranie (7): próbki do 10 l łatwo przewieźć do laboratorium — pobranie i transport według ISO 8199 (także ISO 19458); przy większych objętościach pierwszy etap zatężania najlepiej wykonać na miejscu (może trwać kilka godzin); jeśli równolegle bada się wskaźniki bakteryjne, pobiera się próbkę proporcjonalną, najlepiej z bocznego odpływu aparatu do zatężania; filtry, osady lub inne produkty pierwszego etapu można dalej przetwarzać na miejscu albo przewieźć; warunki transportu i przechowywania etapów pośrednich obejmuje się walidacją. Materiał wzbogacający (8): próbkę ścieku po oczyszczaniu wstępnym lub biologicznym wiruje się przy 1000 g przez 20 min albo sączy przez membranę 8–12 µm; ciecz nad osadem lub przesącz trzyma się w topniejącym lodzie; liczy się fagi docelowe w objętościach 1 ml i w razie potrzeby rozcieńcza do 60–200 pfp/ml; dodaje glicerolu do 5 % objętościowo, miesza, dzieli na porcje 10 ml w butelkach szklanych lub plastikowych (albo probówkach, fiolkach) i zamraża w (−20 ± 5) °C lub (−70 ± 10) °C; rozmraża się dwie butelki w temperaturze pokojowej i z każdej bada dwie porcje 0,5 ml — średnia liczba powinna mieścić się w granicach (30–100 pfp); jednorodność w butelkach i między butelkami sprawdza się statystykami dyspersji Cochrana: T1 (zmienność w obrębie fiolki, I(J−1) stopni swobody) i T2 (zmienność między fiolkami, I−1 stopni swobody), przy I = 2 fiolkach i J = 2 powtórzeniach; przy losowym rozkładzie fagów T1 i T2 mają w przybliżeniu rozkład χ² z 2 i 1 stopniem swobody; materiał jest przydatny, gdy 0,01 < T1 < 5,99 i T2 < 3,84; uwaga: colifagi somatyczne, bakteriofagi F-swoiste RNA i fagi infekujące Bacteroides fragilis naturalnie obecne w częściowo oczyszczonym ścieku nie ulegają istotnej inaktywacji po zamrożeniu z 5 % glicerolem i można je przechowywać poniżej (−20 ± 5) °C, najlepiej w (−70 ± 10) °C, co najmniej rok bez istotnego spadku liczby. Metody okresowe (9.1.1): próbki wszystkich rodzajów wody z zakresu metody, pobierane w różne dni, najlepiej reprezentujące różne pory roku i warunki klimatyczne; dla każdego rodzaju wody co najmniej pięć próbek; Vmax — największa objętość, którą ma przetwarzać metoda; potrzeba co najmniej 3 × Vmax próbki; naczynia z objętościami 0,125, 0,250, 0,500 i 1 × Vmax, do każdego 1 ml materiału wzbogacającego ogrzanego do temperatury pokojowej, reszta materiału w lodzie. Metody ciągłe (9.1.2): badania terenowe dla każdego rodzaju wody w różne dni, co najmniej pięć próbek, te same objętości; 1 ml materiału w ok. 10 ml rozcieńczalnika wstrzykuje się do strumienia wlotowego aparatu (np. igłą strzykawki przez wąż) w czterech podobnych porcjach, każdą po przejściu ok. jednej piątej objętości. Odzysk (9.2): próbki wzbogacone przetwarza się według protokołu, łącznie z transportem i przechowywaniem symulującym próbki rzeczywiste; cały końcowy koncentrat bada się porcjami po 1 ml lub mniejszymi; w miarę możliwości bada się też fagi zatrzymane na powierzchniach zatężania, np. na filtrach; równolegle dwie porcje 0,5 ml materiału wzbogacającego — do obliczenia skuteczności zatężania i T1, T2; jeśli ponad 20 % (1 na 5) próbek materiału nie spełnia T1 lub T2, materiał się odrzuca; jeśli 20 % lub mniej — pomija się wynik tej analizy i powtarza; wartości odstające odrzuca się testem Dixona; co najmniej pięć doświadczeń z wynikami nieodrzuconymi; jeśli woda naturalna może zawierać fagi wykrywane przez tego samego gospodarza, liczy się je — przy liczbie > 20 % fagów dodanych wodę ogrzewa się i utrzymuje w 80 °C przez 30 min i studzi przed użyciem; przy < 20 % liczy się je i uwzględnia w obliczeniach (10).

STATUS (stan na 03.10.2026). W wyszukiwarce PKN (hasło „10705-3”, 03.10.2026) są trzy wyniki: PN-EN ISO 10705-3:2025-06 — wersja polska i wersja angielska, „Wprowadza: EN ISO 10705-3:2024 [IDT], ISO 10705-3:2003 [IDT]”, bez adnotacji o wycofaniu; oraz PN-ISO 10705-3:2021-01 (wersja polska) — „Wycofana i zastąpiona przez PN-EN ISO 10705-3:2025-06 - wersja angielska”. Karta PN-ISO 10705-3:2021-01 (odczyt 03.10.2026): data publikacji 27-01-2021, data wycofania 13-06-2025, wprowadza ISO 10705-3:2003 [IDT], KT 120 „Jakości Wody — Badania Mikrobiologiczne i Biologiczne”, zastąpiona przez PN-EN ISO 10705-3:2025-06 (wersja angielska). Co zmienia wycofanie dla wyniku: obie normy wprowadzają ten sam tekst ISO 10705-3:2003 (nowa — przez EN ISO 10705-3:2024), więc zasady walidacji pozostają te same; zmienia się oznaczenie dokumentu, które powinno stać w zakresie i sprawozdaniu.

ILE LABORATORIÓW I W JAKIEJ POSTACI (kopia bazy zakresów akredytacji, wsad do 17.09.2026, odczyt 03.10.2026). Numer 10705-3 stoi w 2 rekordach u 2 laboratoriów: AB 700 i AB 1095. W aktualnych dokumentach PCA (odczyt 03.10.2026; AB 1095 wyd. nr 25 z 03.07.2026, AB 700 wyd. nr 33 z 21.08.2026) numer stoi u tych samych 2 laboratoriów; w każdym dokumencie liczba znaczników stron równa się liczbie stron PDF, bez powtórzeń; przeszukanie wszystkich dokumentów PCA pobranych z BIP 03.10.2026 nie dało laboratoriów spoza kopii bazy. Postacie: „PN-EN ISO 10705-3:2025-06” (AB 700) i „PN-ISO 10705-3:2021-01” (AB 1095 — wydanie wycofane 13.06.2025), u obu razem z PN-EN ISO 10705-2:2005. Żadna z tych pozycji nie jest zawieszona. Zakładka „Laboratoria” pokazuje AB 700 pod hasłem „PN-EN ISO 10705-3”, a AB 1095 pod hasłem „PN-ISO 10705-3” — sprawdzone zapytaniami zakładki na serwerze produkcyjnym labcoda.pl 03.10.2026.

CO BADAJĄ LABORATORIA (pozycje w PCA). AB 700: woda, woda do spożycia przez ludzi, ścieki — liczba colifagów somatycznych, metoda płytkowa (posiew wgłębny), PN-EN ISO 10705-2:2005 i PN-EN ISO 10705-3:2025-06. AB 1095: woda, woda do spożycia przez ludzi — liczba colifagów somatycznych, metoda płytkowa (posiew wgłębny), PN-EN ISO 10705-2:2005 i PN-ISO 10705-3:2021-01. Liczenie colifagów somatycznych według PN-EN ISO 10705-2 ma w Bazie Wiedzy osobny wpis.

GDZIE ŁATWO O WYNIK POZORNIE POPRAWNY. Przy charakterze normy: to nie metoda zatężania, tylko zasady jej walidacji — konkretną metodę opisuje protokół laboratorium, a przykłady podaje załącznik A (1, 4). Przy zakresie stosowania: zatężanie zaleca się, gdy spodziewane jest mniej niż 3 pfp/ml (1); walidacja obejmuje rodzaje wód i zakres objętości z protokołu, a wyjątki (np. mętność) trzeba w nim opisać (4). Przy materiale wzbogacającym: fagi naturalnie obecne w ścieku; jednorodność sprawdzana T1 i T2, a przy ponad 20 % niezgodności materiał odrzuca się w całości (8, 9.2). Przy próbkach: co najmniej pięć dla każdego rodzaju wody, w różne dni i najlepiej pory roku, w czterech objętościach do Vmax (9.1). Przy odzysku: bada się cały koncentrat i w miarę możliwości fagi zatrzymane na filtrach (9.2). Przy fagach naturalnych: przy ponad 20 % fagów dodanych wodę ogrzewa się 30 min w 80 °C (9.2). Przy transporcie: warunki przewozu i przechowywania etapów pośrednich należą do walidacji (7). Przy wydaniu: AB 1095 powołuje PN-ISO 10705-3:2021-01, wycofaną 13.06.2025 — tekst merytoryczny jest ten sam (ISO 10705-3:2003).

CZEGO NIE PODAJEMY. Wzorów obliczania odzysku (10), wymagań kontroli jakości (11), treści sprawozdania (12) ani metod z załącznika A i przykładu z załącznika B nie przytaczamy — leżą poza próbką. Treści ISO 10705-1, -2 i -4 w tym wpisie nie streszczamy.

Zasada metody

Metodę zatężania, która ma przenieść bakteriofagi z dużej objętości wody (od 100 ml do kilku litrów) do kilku mililitrów, sprawdza się przez odzysk. Przygotowuje się materiał wzbogacający z fagów naturalnie obecnych w ścieku, zamrożony z glicerolem i sprawdzony pod względem jednorodności (testy T1 i T2). Ten sam 1 ml materiału dodaje się do serii objętości badanej wody (do maksymalnej objętości metody), próbki zatęża zgodnie z protokołem i liczy fagi w całym koncentracie znormalizowaną metodą liczenia; stosunek liczby odzyskanej do dodanej, powtarzany w co najmniej pięciu próbkach każdego rodzaju wody, ocenia przydatność metody.

Zastosowania

• Wody z małą liczbą bakteriofagów (< 3 pfp/ml), dla których potrzebne jest zatężanie (1)
• Walidacja metod zatężania okresowych (próbki w naczyniach) i ciągłych (przepływ przez aparat w terenie) (9.1)
• Colifagi somatyczne, bakteriofagi F-swoiste RNA i fagi Bacteroides fragilis — liczenie według ISO 10705-1, -2, -4 (2, 5.3)
• Woda, woda do spożycia przez ludzi i ścieki — liczba colifagów somatycznych (z PN-EN ISO 10705-2) — 2 rekordy zakresów akredytacji 2 laboratoriów w PCA

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 10705-3:2025-06

Tytuł (PL)

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie liczby bakteriofagów — Część 3: Walidacja metod zatężania bakteriofagów z wody

Title (EN)

Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages — Part 3: Validation of methods for concentration of bacteriophages from water

Procedura krok po kroku

1. Protokół metody zatężania

   Grupy fagów, metody wykrywania, rodzaje wód, objętości i wyjątki (4). PN-EN ISO 10705-3:2025-06 — bez adnotacji o wycofaniu (PKN, 03.10.2026).

2. Materiał wzbogacający

   Ściek oczyszczony z cząstek, 60–200 pfp/ml, glicerol 5 %, porcje 10 ml zamrożone; kontrola T1, T2 (8).

3. Próbki wzbogacone

   ≥ 5 próbek każdego rodzaju wody, cztery objętości do Vmax, po 1 ml materiału (9.1).

4. Zatężanie i liczenie

   Według protokołu z transportem i przechowywaniem; cały koncentrat, także fagi na filtrach (9.2).

5. Ocena

   Kontrola materiału (T1, T2), test Dixona, fagi naturalne; obliczenia — poza próbką (9.2, 10).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Sprzęt terenowy dezynfekuje się przed użyciem z zachowaniem środków ostrożności właściwych dla środka dezynfekującego (6)
• Etapy pod ciśnieniem hydrostatycznym lub pneumatycznym wymagają odpowiednich środków ostrożności (6)

Najczęstsze pytania