🦠 Mezofilne bakterie tlenowe w kosmetykach — liczenie kolonii na agarze SCDA/TSA (32,5 °C, 72 h) lub wykrywanie po namnażaniu

Mikrobiologia PN-EN ISO 21149

Przegląd

ISO 21149:2017 podaje ogólne wytyczne liczenia i wykrywania tlenowych bakterii mezofilnych obecnych w kosmetykach: przez liczenie kolonii na podłożu agarowym po inkubacji tlenowej albo przez sprawdzenie braku wzrostu bakterii po namnażaniu. Ze względu na różnorodność produktów metoda może nie być odpowiednia w każdym szczególe (np. dla produktów niemieszających się z wodą); inne metody (np. automatyczne) można stosować po wykazaniu równoważności. W razie potrzeby policzone lub wykryte mikroorganizmy identyfikuje się testami z norm wymienionych w bibliografii. Norma zaleca analizę ryzyka mikrobiologicznego dla ustalenia, do jakich produktów ją stosować; produkty niskiego ryzyka (ISO 29621) to te o niskiej aktywności wodnej, hydroalkoholowe, o skrajnym pH itp.

Metoda zawiera trzy warianty: liczenie płytkowe, filtrację membranową i wykrywanie po namnażaniu. W każdym ewentualne hamowanie wzrostu przez produkt musi być zneutralizowane, a skuteczność neutralizacji sprawdzona i wykazana. W Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 21149:2017-07 ze zmianą A1:2023-01. Laboratoria badające kosmetyki stosują ją do oznaczania „tlenowych mikroorganizmów mezofilnych” na agarze TSA (bakterie), równolegle z PN-EN ISO 16212 na agarze SDA (grzyby).

Zasada metody

Liczenie płytkowe: przygotowanie płytek wgłębnych lub powierzchniowych na określonym podłożu i inokulacja określoną ilością zawiesiny wyjściowej lub jej rozcieńczenia; inkubacja tlenowa w (32,5 ± 2,5) °C przez 72 h ± 6 h; policzenie jednostek tworzących kolonie (jtk) i obliczenie liczby tlenowych bakterii mezofilnych na mililitr lub gram produktu. Filtracja membranowa: odpowiednią ilość przygotowanej próbki przenosi się do aparatu filtracyjnego zwilżonego jałowym rozcieńczalnikiem, natychmiast filtruje i przemywa, a filtr przenosi na powierzchnię podłoża agarowego (wg ISO 21148); inkubacja jak wyżej. Wykrywanie po namnażaniu: inkubacja określonej ilości zawiesiny wyjściowej w nieselektywnym podłożu płynnym z neutralizatorami i/lub środkami dyspergującymi w (32,5 ± 2,5) °C przez co najmniej 20 h, przeniesienie określonej ilości na nieselektywny agar, inkubacja tlenowa 48–72 h w tej samej temperaturze i wynik jako obecność/brak bakterii tlenowych mezofilnych w próbce S produktu. Podłoża: rozcieńczalnik neutralizujący SCDLP 20 (trawiony trzustkowo kazeina 20,0 g, lecytyna sojowa 5,0 g, polisorbat 20 40,0 ml, woda 960 ml; polisorbat rozpuszcza się w łaźni (49 ± 2) °C, po dodaniu składników ogrzewa ok. 30 min; sterylizacja 121 °C, 15 min), agar sojowo-kazeinowy (SCDA) lub agar tryptozowo-sojowy (TSA) do liczenia, bulion i agar Eugon LT 100 do wykrywania.

Zastosowania

• Rutynowa kontrola czystości mikrobiologicznej kosmetyków — liczba tlenowych bakterii mezofilnych (jtk/g, jtk/ml)
• Produkty o wysokim ryzyku mikrobiologicznym na bazie wody (żele, kremy, balsamy) — zwalnianie serii
• Produkty, dla których wymagany jest tylko wynik „obecność/brak” — wariant z namnażaniem
• Produkty o niskiej liczbie bakterii lub trudne do posiewu płytkowego — filtracja membranowa
• Badania skuteczności zakonserwowania (test obciążeniowy) — liczenie przeżywających bakterii

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 21149:2017-07 + A1:2023-01 (ISO 21149:2017 + Amd 1:2022)

Tytuł (PL)

Kosmetyki — Mikrobiologia — Zliczanie i wykrywanie mezofilnych bakterii tlenowych

Title (EN)

Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria

Procedura krok po kroku

1. Zawiesina wyjściowa

   Pobierz co najmniej 1 g lub 1 ml produktu i sporządź zawiesinę wyjściową w rozcieńczalniku neutralizującym (np. SCDLP 20) z ewentualnym środkiem dyspergującym; przygotuj rozcieńczenia.

2. Sprawdzenie neutralizacji

   Sprawdź i wykaż skuteczność neutralizacji właściwości przeciwbakteryjnych produktu (wymagane w każdym wariancie metody).

3. Wariant A — liczenie płytkowe

   Posiej określoną ilość zawiesiny wyjściowej lub rozcieńczenia wgłębnie lub powierzchniowo na agar sojowo-kazeinowy (SCDA/TSA).

4. Wariant B — filtracja membranowa

   Przenieś odpowiednią ilość próbki do aparatu filtracyjnego zwilżonego jałowym rozcieńczalnikiem, natychmiast przefiltruj, przemyj wg procedury i przenieś filtr na powierzchnię agaru (ISO 21148).

5. Inkubacja i liczenie

   Inkubuj tlenowo w (32,5 ± 2,5) °C przez 72 h ± 6 h; policz jtk i oblicz liczbę bakterii tlenowych mezofilnych na ml lub g produktu.

6. Wariant C — wykrywanie po namnażaniu

   Inkubuj określoną ilość zawiesiny wyjściowej w nieselektywnym bulionie z neutralizatorami (Eugon LT 100) w (32,5 ± 2,5) °C co najmniej 20 h, przenieś określoną ilość na nieselektywny agar i inkubuj tlenowo 48–72 h; oceń wzrost.

7. Wynik

   Podaj jtk/ml lub jtk/g produktu albo obecność/brak bakterii tlenowych mezofilnych w próbce S; w razie potrzeby zidentyfikuj izolaty.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Hodowle bakterii o nieznanej przynależności — praca w warunkach laboratorium mikrobiologicznego, autoklawowanie odpadów
• Gorące podłoża (łaźnia 49 °C, autoklaw 121 °C) — ryzyko poparzenia
• Filtracja membranowa pod próżnią — sprawny sprzęt szklany

Najczęstsze pytania