🦠 Oznaczanie liczby bakterii redukujących siarczany(IV) rosnących w warunkach beztlenowych w żywności, paszach i próbkach środowiskowych z produkcji żywności — po 1 ml próbki płynnej albo zawiesiny wyjściowej i kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych (po dwie płytki) zalewa się agarem siarczynowo-żelazowym schłodzonym do 44–47 °C, po zastygnięciu nadwarstwą 5–10 ml i inkubuje w anaerostatach w 37 ± 1 °C przez 24–48 h (przy podejrzeniu bakterii termofilnych drugi komplet w 50 ± 1 °C); liczy się czarne kolonie (siarczek żelaza(II)) na płytkach z mniej niż 150 typowymi i mniej niż 300 wszystkimi koloniami; opcjonalna obróbka cieplna zawiesiny daje liczbę przetrwalników, PN-ISO 15213

Mikrobiologia PN-ISO 15213

Przegląd

CO TA NORMA OPISUJE. Tekst normy czytamy w próbce iTeh dokumentu ISO 15213:2003 (tekst angielski, pierwsze wydanie z 01.05.2003): strona tytułowa, przedmowa, wprowadzenie, rozdziały 1–11 i nagłówek załącznika A (normatywnego, „Diagram of procedure”) — próbka kończy się na stronie 5, przed samym schematem. Wartości liczbowe (temperatury, czasy, objętości, skład podłoża) w tekście pierwotnym wypadają poza zdania — przypisujemy je według układu strony (pdftotext -layout). Część zdania w 9.5 jest w próbce zasłonięta znakiem wodnym. Następczynię czytamy w próbce iTeh dokumentu SIST EN ISO 15213-1:2023 (spis treści, przedmowa z listą zmian, wprowadzenie).

WEDŁUG TEKSTU ISO 15213:2003. Normę przygotował ISO/TC 34 „Produkty spożywcze”, podkomitet SC 9 „Mikrobiologia”. Wprowadzenie: metoda horyzontalna może nie pasować w każdym szczególe do niektórych produktów — wtedy, z uzasadnionych przyczyn technicznych, można użyć metod swoistych. Zakres (1): oznaczanie liczby bakterii redukujących siarczyny rosnących w warunkach beztlenowych w produktach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt oraz w próbkach środowiskowych z obszaru produkcji żywności i obrotu nią. Powołania (2): ISO 6887-1:1999, ISO 8261 (mleko), ISO 7218:1996 z Amd 1:2001, ISO/TS 11133-1. Definicja (3.1): bakterie tworzące policzalne typowe kolonie w warunkach tej normy. Zasada (4): dwie płytki (albo probówki) z agarem siarczynowo-żelazowym z określoną ilością próbki płynnej albo zawiesiny wyjściowej i dwie z rozcieńczeniami dziesiętnymi; inkubacja beztlenowa w 37 ± 1 °C przez 24–48 h (odczyt końcowy po 48 h), ewentualnie w 50 °C przy podejrzeniu bakterii termofilnych; liczy się typowe czarne kolonie — czerń kolonii i strefy wokół to siarczek żelaza(II) z reakcji jonów siarczkowych z żelazem(III) podłoża; wynik na mililitr albo gram. Podłoże (5.1): hydrolizat enzymatyczny kazeiny 15 g, trzustkowy hydrolizat soi 5 g, ekstrakt drożdżowy 5 g, disiarczyn disodu (Na2S2O5) 1 g, cytrynian żelaza(III) amonu 1 g, agar 9–18 g (zależnie od siły żelowania), woda 1000 ml; pH po sterylizacji 7,6 ± 0,2 w 25 °C; porcje 250 ml w kolbach 500 ml, do probówek 20 lub 25 ml; sterylizacja 15 min w 121 °C; tuż przed użyciem odpowietrzenie; rozcieńczalnik — sól fizjologiczna z peptonem według ISO 6887-1:1999, 5.2.1. Aparatura (6): homogenizator, łaźnia wodna 44–47 °C, anaerostaty z systemem kontroli warunków beztlenowych, cieplarka 37 ± 1 °C i w razie potrzeby 50 ± 1 °C, probówki 16 mm × 160 mm, kolby 500 ml. Pobieranie (7): nie jest częścią metody. Przygotowanie (8, 9.2): według ISO 6887-1, ISO 8261 albo norm szczegółowych; obróbka cieplna zawiesiny wyjściowej bywa potrzebna do usunięcia form wegetatywnych — od działania pasteryzacyjnego z umiarkowaną aktywacją cieplną (np. 75 °C przez 20 min) do gotowania przez kilka minut; wtedy wynik można podać jako liczbę przetrwalników. Posiew (9.3): po 1 ml próbki płynnej albo zawiesiny wyjściowej na dwie płytki, po 1 ml pierwszego rozcieńczenia dziesiętnego (10−1 dla próbki płynnej, 10−2 dla zawiesiny wyjściowej — tak w tekście) na dwie kolejne, i dalsze rozcieńczenia; do każdej płytki wlewa się agar schłodzony w łaźni do 44–47 °C — w tekście próbki „approximately 15 min of iron sulfite agar” (jednostka objętości zapisana jako „min”); czas od posiewu do wlania agaru nie powinien przekraczać 15 min; po zastygnięciu nadwarstwa 5–10 ml tego samego podłoża; w probówkach — po 1 ml do dwóch probówek z podłożem w 44–47 °C, zestalenie w zimnej łaźni, nadwarstwa 2–3 ml. Inkubacja (9.4): płytki w anaerostatach w 37 ± 1 °C przez 24–48 h, przy podejrzeniu bakterii termofilnych drugi komplet w 50 ± 1 °C; probówek nie trzeba umieszczać w anaerostatach. Liczenie (9.5): odczyt po 24 i 48 h; czarne kolonie, ewentualnie z czarną strefą, liczy się jako bakterie redukujące siarczyny; uwaga 1 — rozlane, nieswoiste zaczernienie podłoża zdarza się zwłaszcza w probówkach, a beztlenowce wytwarzające tylko wodór (nie H2S) też mogą redukować siarczyn i zaczerniać podłoże; liczy się płytki z mniej niż 150 typowymi i mniej niż 300 wszystkimi koloniami; w probówkach tylko te z wyraźnie oddzielonymi koloniami; uwaga 2 — normą można liczyć tylko Clostridium, potwierdzając rodzaj na pięciu koloniach z każdej płytki (np. testy oddechowe, tworzenie przetrwalników). Wyrażanie wyników (10): według Amd 1 do ISO 7218:1996. Sprawozdanie (11): m.in. metoda z temperaturą inkubacji, użycie probówek i obróbka cieplna.

CO ZASTĄPIŁO NORMĘ I CO ZMIENIŁO SIĘ DLA WYNIKU (według przedmowy ISO 15213-1:2023). Pierwsze wydanie ISO 15213-1 anuluje i zastępuje ISO 15213:2003, technicznie zmienione; norma powstała we współpracy z CEN/TC 463. Główne zmiany: zakres poszerzony o próbki z produkcji pierwotnej; przedmiotem są już „Clostridium spp. redukujące siarczyny”, a nie „bakterie redukujące siarczyny” — typowe kolonie się potwierdza; stężenie siarczynu w agarze obniżono z 1,0 g/l do 0,5 g/l; obróbka cieplna 10 min w 80 °C jest opcjonalna (przy dużej florze towarzyszącej albo do liczenia samych przetrwalników); usunięto posiew w probówkach i inkubację w 50 °C dla bakterii termofilnych; dodano opis potwierdzenia, zmieniono schemat w załączniku A, dodano charakterystykę metody (załącznik C) i protokół dla pasz (załącznik D). Według wprowadzenia zmiany są „major” w rozumieniu ISO 17468 i mają duży wpływ na charakterystykę metody. Seria obejmuje też ISO 15213-2 (liczba C. perfringens) i ISO/TS 15213-3 (wykrywanie C. perfringens).

STATUS (stan na 03.10.2026). W wyszukiwarce PKN (hasło „15213”, 03.10.2026) PN-ISO 15213:2005 (wersja polska, „Wprowadza: ISO 15213:2003 [IDT]”) — „Wycofana i zastąpiona przez PN-EN ISO 15213-1:2023-08 – wersja angielska”. Karta: data publikacji 29.06.2005, data wycofania 23.02.2024, 12 stron, KT 3 Mikrobiologii Łańcucha Żywnościowego, ICS 07.100.30, „Zastępuje PN-A-86034-12:1993”. Karta PN-EN ISO 15213-1:2023-08 (wersja angielska): publikacja 08.08.2023, 34 strony, KT 3, wprowadza EN ISO 15213-1:2023 i ISO 15213-1:2023, „Zastępuje PN-ISO 15213:2005”, element dodatkowy PN-EN ISO 15213-1:2023-08/Ap1:2024-02E, bez adnotacji o wycofaniu. W katalogu iTeh (odczyt 03.10.2026) ISO 15213:2003 ma status „Withdrawn”, etap 95.99, zrewidowana przez ISO 15213-1:2023, ISO 15213-2:2023 i ISO/TS 15213-3:2024.

ILE LABORATORIÓW I W JAKIEJ POSTACI (kopia bazy zakresów akredytacji, wsad do 17.09.2026, odczyt 03.10.2026). Numer „15213” bez numeru części stoi w 4 rekordach u 3 laboratoriów: AB 285 (2), AB 418, AB 1866. W aktualnych dokumentach PCA (odczyt 03.10.2026; AB 285 wyd. nr 28 z 13.01.2026, AB 418 wyd. nr 37 z 26.01.2026, AB 1866 wyd. nr 4 z 09.06.2026) numer stoi w 4 wierszach u tych samych 3 laboratoriów; w każdym dokumencie liczba znaczników stron równa się liczbie stron PDF, bez powtórzeń; przeszukanie wszystkich dokumentów PCA pobranych z BIP 03.10.2026 nie dało laboratoriów spoza kopii bazy. Postać zawsze „PN-ISO 15213:2005”. Żadna z tych pozycji nie jest zawieszona. AB 285 ma w tym samym dokumencie także pozycję z PN-EN ISO 15213-1:2023-08. Zakładka „Laboratoria” (hasło „PN-ISO 15213”) pokazuje 5 laboratoriów — AB 285, AB 418, AB 1866 oraz AB 400 i AB 1179 — sprawdzone zapytaniem zakładki na serwerze produkcyjnym labcoda.pl 03.10.2026; AB 400 i AB 1179 trafiają tam przez zapisy części nowej serii z przedrostkiem „PN-ISO” („PN-ISO 15213-1”, „PN-ISO 15213-2” u AB 400; „PN-ISO 15213-1:2023-08” u AB 1179), a nie przez wycofaną normę.

NASTĘPCZYNI W ZAKRESACH (odczyt 03.10.2026). Część 1 nowej serii („15213-1” w dowolnej postaci) stoi w aktualnych dokumentach PCA u 11 laboratoriów: AB 285, AB 313, AB 370, AB 400, AB 452, AB 462, AB 819, AB 924, AB 1179, AB 1415, AB 1651; w kopii bazy u 10 (bez AB 1651). Część 2 (C. perfringens) — w kopii bazy u 11 laboratoriów.

CO BADAJĄ LABORATORIA (pozycje w PCA). AB 285: liczba bakterii beztlenowych redukujących siarczany(IV) w przetworach z owoców i warzyw, mięsnych i rybnych oraz liczba ich przetrwalników także w mleku i przetworach mlecznych i soku jabłkowym; AB 418: przetrwalniki beztlenowców, w tym redukujących siarczany(IV), w odpadach (grupy I, IV, V, VI, IX, XI i inne według DAB-11), z przypisem odsyłającym do rozporządzenia Ministra Klimatu z 24.12.2019 r. w sprawie warunków uznania odpadów za posiadające właściwości zakaźne; AB 1866: liczba drobnoustrojów beztlenowych (redukujących siarczany(IV)) w środkach wspomagających uprawę roślin (polepszacze gleby, podłoża, nawozowe produkty mikrobiologiczne). Technika: metoda płytkowa (posiew wgłębny).

GDZIE ŁATWO O WYNIK POZORNIE POPRAWNY. Przy statusie: wszystkie trzy laboratoria powołują PN-ISO 15213:2005, wycofaną w PKN 23.02.2024; następczyni liczy inną wielkość — tylko Clostridium spp. z potwierdzeniem — na podłożu z połową siarczynu, więc wyniki obu norm nie są zamienne (przedmowa i wprowadzenie ISO 15213-1). Przy przedmiocie: zakres normy to żywność, pasze i próbki środowiskowe z produkcji żywności (1) — odpady (AB 418) i środki wspomagające uprawę roślin (AB 1866) w nim nie są wymienione. Przy odczycie: zaczernienie podłoża bywa nieswoiste, zwłaszcza w probówkach, a beztlenowce wytwarzające tylko wodór też redukują siarczyn (9.5, uwaga 1). Przy przetrwalnikach: obróbka cieplna (np. 75 °C, 20 min) zmienia wielkość oznaczaną na liczbę przetrwalników i musi być w sprawozdaniu (9.2, 11 c). Przy liczeniu: tylko płytki z mniej niż 150 typowymi i mniej niż 300 wszystkimi koloniami (9.5). Przy temperaturze: druga seria w 50 °C tylko przy podejrzeniu bakterii termofilnych (9.4) — w następczyni tej opcji już nie ma. Przy tekście: objętość agaru w 9.3 zapisano w próbce jako „15 min” — normy nie poprawiamy, odnotowujemy zapis.

CZEGO NIE PODAJEMY. Schematu z załącznika A ani sposobu wyrażania wyników z Amd 1 do ISO 7218 nie przytaczamy. Treści ISO 15213-1:2023 poza przedmową i wprowadzeniem (podłoża, potwierdzenie, dane precyzji, protokół dla pasz) nie czytaliśmy.

Zasada metody

Próbkę płynną albo zawiesinę wyjściową i jej rozcieńczenia dziesiętne posiewa się po 1 ml na dwie płytki, zalewa agarem siarczynowo-żelazowym (disiarczyn disodu i cytrynian żelaza(III) amonu po 1 g/l) w 44–47 °C, po zastygnięciu pokrywa nadwarstwą i inkubuje beztlenowo w 37 °C przez 24–48 h. Bakterie redukujące siarczyny wytwarzają siarczki, które z żelazem(III) podłoża dają czarny siarczek żelaza(II); czarne kolonie liczy się na płytkach z mniej niż 150 typowymi koloniami i przelicza na gram lub mililitr. Obróbka cieplna zawiesiny zawęża wynik do przetrwalników.

Zastosowania

• Bakterie redukujące siarczyny w warunkach beztlenowych w żywności, paszach i próbkach środowiskowych z produkcji żywności (1)
• Liczba przetrwalników po obróbce cieplnej zawiesiny; po potwierdzeniu — Clostridium (9.2, 9.5)
• Przetwory owocowe, warzywne, mięsne, rybne i mleczne, odpady, środki wspomagające uprawę roślin — pozycje w zakresach akredytacji 3 laboratoriów w PCA

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-ISO 15213:2005

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby bakterii redukujących siarczany(IV) rosnących w warunkach beztlenowych

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of sulfite-reducing bacteria growing under anaerobic conditions

Procedura krok po kroku

1. Zawiesina i rozcieńczenia

   Według ISO 6887-1, ISO 8261 albo normy szczegółowej; ewentualna obróbka cieplna dla przetrwalników (9.2). PN-ISO 15213:2005 wycofana w PKN 23.02.2024 (03.10.2026).

2. Posiew

   Po 1 ml na dwie płytki z każdego poziomu; agar 44–47 °C wlany w ciągu 15 min od posiewu; nadwarstwa 5–10 ml (9.3).

3. Inkubacja

   Beztlenowo, 37 ± 1 °C, 24–48 h; przy termofilach druga seria 50 ± 1 °C (9.4).

4. Liczenie

   Czarne kolonie po 24 i 48 h; płytki < 150 typowych i < 300 wszystkich kolonii (9.5).

5. Wynik

   Liczba na gram lub mililitr według Amd 1 do ISO 7218:1996; w sprawozdaniu temperatura, probówki i obróbka cieplna (10, 11).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Praca z bakteriami beztlenowymi, w tym potencjalnie chorobotwórczymi Clostridium — praktyka mikrobiologiczna według ISO 7218
• Sterylizacja w autoklawie 121 °C; gorące podłoże i łaźnia wodna

Najczęstsze pytania