🦠 Bakterie z grupy coli w żywności — wykrywanie i NPL w bulionie laurylowo-tryptozowym

Mikrobiologia PN-ISO 4831

Przegląd

ISO 4831:2006 podaje ogólne wytyczne wykrywania i oznaczania liczby bakterii z grupy coli w produktach dla ludzi i zwierząt oraz w próbkach środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością; liczbę oznacza się jako najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL) po inkubacji w podłożu płynnym w 30 °C lub 37 °C (temperatura do uzgodnienia; mleko i przetwory mleczne — 30 °C). Metoda oznaczania ma zastosowanie, gdy spodziewana liczba wynosi 1–100 na ml lub g. Jest mniej precyzyjna niż metoda płytkowa ISO 4832, ale pozwala badać większą porcję i wykrywać mniejsze liczby bakterii na gram; definicje „bakterii grupy coli” w obu normach są różne. Bakterie grupy coli definiuje się tu jako bakterie, które w uzgodnionej temperaturze fermentują laktozę z wytworzeniem gazu; część szczepów opisywanych jako coli (w tym E. coli) nie wytwarza dość gazu, by wykryć go w rurce Durhama (szczepy anaerogenne), więc metoda nie wykryje wszystkich „domniemanych coli” (np. niektórych Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella). Ograniczeniem jest duża zmienność metody (rozdz. 11). W skryptach UWM ta sama metoda opisana jest jako 3-probówkowe oznaczanie NPL w pożywce z siarczanem sodowo-laurylowym (30 °C/48 h) z potwierdzeniem w pożywce z laktozą, żółcią i zielenią brylantową.

Zasada metody

Wykrywanie: probówkę selektywnego bulionu namnażającego inokuluje się porcją próbki i inkubuje w 30 °C lub 37 °C 24 h lub 48 h; z probówek ze zmętnieniem lub gazem przesiewa się do podłoża potwierdzającego (24 h lub 48 h); obecność coli potwierdza zmętnienie i gaz. Oznaczanie NPL: trzy probówki podwójnie stężonego bulionu inokuluje się określoną ilością próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej, trzy probówki pojedynczo stężonego — tą samą ilością, a kolejne probówki pojedynczo stężone — rozcieńczeniami dziesiętnymi; podwójnie stężone inkubuje się 24 h, pojedynczo stężone 24 h lub 48 h, po czym sprawdza gaz lub zmętnienie uniemożliwiające jego stwierdzenie; z hodowli podwójnie stężonych i z pojedynczo stężonych z gazem/zmętnieniem przesiewa się do bulionu potwierdzającego, inkubuje 24 h lub 48 h i z liczby probówek z gazem odczytuje NPL z tablicy. Bulion laurylowo-tryptozowy (LST): hydrolizat białek mleka i zwierzęcych 20 g (40 g w podwójnie stężonym), laktoza 5 g (10 g), K₂HPO₄ 2,75 g (5,5 g), KH₂PO₄ 2,75 g (5,5 g), NaCl 5 g (10 g), laurylosiarczan sodu 0,1 g (0,2 g) na 1000 ml; pH 6,8 ± 0,2; po 10 ml w probówkach 16 × 160 mm z rurkami Durhama (pojedynczo stężony) lub 20 × 200 mm bez rurek (podwójnie stężony); 121 °C 15 min. Bulion potwierdzający: hydrolizat kazeiny 10 g, laktoza 10 g, sucha żółć wołowa 20 g, zieleń brylantowa 0,0133 g/l; pH 7,2 ± 0,2; 10 ml z rurką Durhama. Po sterylizacji rurki Durhama nie mogą zawierać pęcherzyków powietrza.

Zastosowania

• Wykrywanie obecności bakterii grupy coli w określonej ilości produktu (np. 1 g/1 ml) — kontrola higieny w zakładach
• Oznaczanie małych liczb coli (1–100 jtk/g) w mleku i przetworach mlecznych (30 °C), lodach, wyrobach garmażeryjnych
• Próbki środowiskowe z obszarów produkcji i obrotu żywnością
• Pasze i surowce, gdy metoda płytkowa jest zbyt mało czuła
• Kryteria dodatkowe w normach zakładowych i specyfikacjach odbiorców

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-ISO 4831:2007 (ISO 4831:2006)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby bakterii z grupy coli — Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of coliforms — Most probable number technique

Procedura krok po kroku

1. Próbka

   Przygotuj próbkę, zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesiętne wg ISO 6887 (odpowiednia część), ISO 8261 lub normy dla produktu.

2. Wykrywanie — inokulacja

   Zależnie od wymaganej granicy wykrywalności przenieś x ml próbki lub zawiesiny do 10 ml bulionu podwójnie stężonego (1 ml < x < 10 ml) lub pojedynczo stężonego (x ≤ 1 ml); inkubuj 24 h ± 2 h (podwójnie stężony) lub 24 h ± 2 h i przy braku gazu/zmętnienia dalsze 24 h ± 2 h (pojedynczo stężony).

3. Wykrywanie — potwierdzenie

   Z probówki podwójnie stężonej oraz z probówek pojedynczo stężonych z gazem lub zmętnieniem przesiej ezą do bulionu potwierdzającego; inkubuj 24 h ± 2 h, przy braku gazu do 48 h ± 2 h; probówka z gazem = dodatnia (obecność coli w x g/ml).

4. NPL — inokulacja

   Inokuluj trzy probówki bulionu podwójnie stężonego i trzy pojedynczo stężonego określoną ilością próbki lub zawiesiny wyjściowej, a kolejne trójki probówek pojedynczo stężonych — rozcieńczeniami dziesiętnymi (co najmniej trzy kolejne rozcieńczenia).

5. NPL — inkubacja i przesiew

   Inkubuj jak wyżej; z hodowli podwójnie stężonych i z pojedynczo stężonych z gazem lub zmętnieniem uniemożliwiającym stwierdzenie gazu przesiej do bulionu potwierdzającego i inkubuj 24 h lub 48 h.

6. Odczyt NPL

   Z liczby probówek potwierdzających z gazem w każdej serii odczytaj NPL na ml lub g z tablicy; uwzględnij zmienność metody (rozdz. 11) przy interpretacji; w sprawozdaniu podaj temperaturę inkubacji i odstępstwa.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Hodowle mogą zawierać patogenne Enterobacteriaceae — praca w warunkach laboratorium mikrobiologicznego, autoklawowanie odpadów
• Zieleń brylantowa i sole żółciowe — unikać pylenia przy odważaniu
• Rurki Durhama — ostrożnie przy otwieraniu probówek z gazem

Najczęstsze pytania