🦠 Bakterie z grupy coli w żywności — metoda płytkowa (posiew wgłębny na agar VRBL)

Mikrobiologia PN-ISO 4832

Przegląd

ISO 4832:2006 podaje ogólne wytyczne oznaczania liczby bakterii z grupy coli w produktach przeznaczonych dla ludzi i zwierząt oraz w próbkach środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością metodą liczenia kolonii po inkubacji na podłożu stałym w 30 °C lub 37 °C (temperatura do uzgodnienia między stronami; dla mleka i przetworów mlecznych 30 °C). Technikę zaleca się, gdy spodziewana liczba kolonii przekracza 100 na ml lub g. Jest precyzyjniejsza niż metoda NPL z ISO 4831, ale nie pozwala badać tak dużej porcji, dlatego preferuje się ją przy dużej liczbie bakterii; definicje „bakterii grupy coli” w obu normach są różne, więc oznaczane mikroorganizmy nie muszą być te same. Bakterie grupy coli definiuje się tu jako bakterie tworzące w uzgodnionej temperaturze charakterystyczne kolonie na agarze z fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i laktozą, które w teście potwierdzającym fermentują laktozę z wytworzeniem gazu; metoda wykrywa średnio około 90 % szczepów opisywanych w innych publikacjach jako „domniemane coli” (np. niektóre Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella). Precyzja: przy rozkładzie Poissona granice ufności ± 16 % do ± 52 %; w badaniach międzylaboratoryjnych sr = 0,20 log, sR = 0,35 log. W skryptach akademickich (UWM) metoda ta figuruje jako „kryterium dodatkowe” oznaczane przez producentów żywności: posiew na agar VRBL, 37 °C/24 h, liczenie ciemnopurpurowo-czerwonych kolonii otoczonych czerwoną strefą.

Zasada metody

Przygotowuje się dwie płytki metodą wgłębną z określoną ilością próbki (produkt płynny) lub zawiesiny wyjściowej oraz kolejne pary płytek z rozcieńczeń dziesiętnych; płytki inkubuje się 24 h w 30 °C lub 37 °C; liczy się kolonie charakterystyczne i, jeśli trzeba, potwierdza fermentację laktozy; liczbę bakterii na ml lub g oblicza się wg ISO 7218. Podłoże VRBL (agar z fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i laktozą): hydrolizat enzymatyczny tkanek zwierzęcych 7 g, ekstrakt drożdżowy 3 g, laktoza 10 g, NaCl 5 g, sole żółciowe 1,5 g, czerwień obojętna 0,03 g, fiolet krystaliczny 0,002 g, agar 12–18 g, woda 1000 ml; pH po gotowaniu 7,4 ± 0,2 w 25 °C; podłoże doprowadza się do wrzenia, gotuje 2 min, natychmiast chłodzi w łaźni 44–47 °C, nie autoklawuje i nie odgrzewa, zużywa w ciągu 4 h, a jałowość sprawdza płytką kontrolną. Podłoże potwierdzające — bulion z laktozą, żółcią i zielenią brylantową (hydrolizat kazeiny 10 g, laktoza 10 g, sucha żółć wołowa 20 g, zieleń brylantowa 0,0133 g/l; pH 7,2 ± 0,2; po 10 ml w probówkach z rurkami Durhama; 121 °C 15 min). Czas od zakończenia przygotowania zawiesiny wyjściowej do zalania płytek nie może przekroczyć 15 min.

Zastosowania

• Kontrola higieny produkcji żywności (mięso, przetwory mleczne, wyroby garmażeryjne) przy spodziewanej liczbie coli > 100/g
• Mleko i przetwory mleczne — inkubacja 30 °C
• Próbki środowiskowe z obszarów produkcji i obrotu żywnością
• Pasze i surowce roślinne
• Badania w ramach norm zakładowych i specyfikacji odbiorców (kryterium dodatkowe poza rozp. 2073/2005)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-ISO 4832:2007 (ISO 4832:2006)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby bakterii z grupy coli — Metoda płytkowa

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of coliforms — Colony-count technique

Procedura krok po kroku

1. Próbka i rozcieńczenia

   Przygotuj próbkę, zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesiętne wg ISO 6887 (odpowiednia część), ISO 8261 lub normy dla produktu.

2. Posiew

   Na środek każdej z dwóch płytek przenieś jałową pipetą 1 ml produktu płynnego lub wybranego rozcieńczenia (osobna pipeta na rozcieńczenie).

3. Zalanie podłożem

   Do każdej płytki wlej ok. 15 ml VRBL o temperaturze 44–47 °C (nie później niż 15 min od przygotowania zawiesiny), ostrożnie wymieszaj i pozostaw do zestalenia na zimnej poziomej powierzchni; przygotuj płytkę kontrolną z 15 ml podłoża do sprawdzenia jałowości.

4. Warstwa wierzchnia

   Po całkowitym zestaleniu nałóż ok. 4 ml VRBL (44–47 °C) na powierzchnię i pozostaw do zestalenia.

5. Inkubacja

   Odwrócone płytki inkubuj 24 h ± 2 h w 30 °C lub 37 °C (jak uzgodniono).

6. Liczenie

   Wybierz płytki z 10–150 koloniami; policz purpurowoczerwone kolonie o średnicy ≥ 0,5 mm (czasem z czerwonawą strefą wytrąconej żółci) — typowe, bez potwierdzania. Policz i potwierdź kolonie nietypowe (np. mniejsze) oraz wszystkie kolonie z przetworów mlecznych zawierających cukry inne niż laktoza.

7. Potwierdzenie i wynik

   Po pięć kolonii każdego typu nietypowego posiej do bulionu z laktozą, żółcią i zielenią brylantową, inkubuj 24 h ± 2 h w tej samej temperaturze; za coli uznaj kolonie dające gaz w rurce Durhama i uwzględnij je w obliczeniu; wynik wg ISO 7218; w sprawozdaniu podaj temperaturę inkubacji, metodę pobierania i odstępstwa.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Gotowanie podłoża VRBL i praca z agarem 44–47 °C — ochrona przed poparzeniem; nie odgrzewać podłoża
• Hodowle mogą zawierać patogenne Enterobacteriaceae — dobra praktyka mikrobiologiczna, autoklawowanie odpadów
• Fiolet krystaliczny i zieleń brylantowa — unikać kontaktu ze skórą i pylenia przy odważaniu

Najczęstsze pytania