Zarejestruj się
LabCoda / Baza Wiedzy / Bacillus cereus w żywności

🧫 Bacillus cereus w żywności

Mikrobiologia PN-EN ISO 7932

Oznaczanie liczby domniemanego Bacillus cereus w żywności metodą posiewu powierzchniowego na agarze MYP (Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin) w temperaturze 30°C z potwierdzeniem hemolizą.

Przegląd

Bacillus cereus jest bakterią Gram-dodatnią, tlenową, przetrwalnikującą, szeroko rozpowszechnioną w środowisku — występuje w glebie, kurzu, roślinach i wielu surowcach spożywczych. B. cereus wywołuje dwa typy zatruć pokarmowych: zespół wymiotny (typ emetyczny, spowodowany toksyną cereulidową — inkubacja 1–5 h) oraz zespół biegunkowy (typ diareiczny, spowodowany enterotoksynami Hbl, Nhe, CytK — inkubacja 8–16 h).

Norma PN-EN ISO 7932 określa horyzontalną metodę oznaczania liczby domniemanych B. cereus metodą liczenia kolonii na podłożu MYP (Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin Agar, podłoże Mossela). Podłoże opiera się na trzech mechanizmach różnicowania: niezdolności B. cereus do fermentacji mannitolu (kolonie różowe na tle czerwonego fenolu), produkcji lecytynazy (strefa białego precypitatu wokół kolonii z żółtka jaja) oraz oporności na polimyksynę B (hamowanie bakterii Gram-ujemnych).

Termin „domniemany" (presumptive) wynika z faktu, że metoda nie pozwala na pełne odróżnienie B. cereus od blisko spokrewnionych gatunków grupy B. cereus sensu lato (B. thuringiensis, B. mycoides, B. weihenstephanensis, B. anthracis). Potwierdzenie opiera się na teście hemolizy na agarze z krwią baranią.

Metoda jest wymagana w kontroli jakości ryżu, makaronów, sosów, przypraw, produktów mlecznych, żywności dla niemowląt i potraw gotowych. B. cereus stanowi szczególne zagrożenie w cateringu i gastronomii, gdzie błędy w chłodzeniu i podgrzewaniu potraw sprzyjają namnażaniu bakterii.

Zasada metody

Metoda wykorzystuje podłoże MYP, w którym mannitol i czerwień fenolowa stanowią system indykatorowy (B. cereus nie fermentuje mannitolu — kolonie różowe), emulsja żółtka jaja wykrywa lecytynazę (strefa białego precypitatu), a polimyksyna B hamuje wzrost bakterii Gram-ujemnych. Próbkę posiewamy powierzchniowo i inkubujemy w 30 ± 1°C przez 24 h. Typowe kolonie B. cereus są duże (ok. 5 mm), różowe, szorstkie, suche, otoczone strefą białego precypitatu. Potwierdzenie wykonuje się testem hemolizy — B. cereus wykazuje silną β-hemolizę na agarze z krwią baranią.

Zastosowania

Kluczowe parametry

ParametrWartość
Temperatura inkubacji30 ± 1°C
Czas inkubacji18–24 h (MYP), 24 ± 2 h (hemoliza)
PodłożeMYP Agar (Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin, podłoże Mossela)
Typ koloniiDuże (~5 mm), różowe, suche, z białym precypitatem
Metoda posiewuPowierzchniowy (spread plate), 0,1 mL na płytkę
PotwierdzenieTest hemolizy na agarze z krwią baranią (β-hemoliza)

Norma

Numer normy
PN-EN ISO 7932:2005
Tytuł (PL)
Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby domniemanego Bacillus cereus — Metoda liczenia kolonii w temperaturze 30°C
Title (EN)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 degrees C

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie próbki

Odważ 10 g próbki do woreczka stomachera, dodaj 90 mL BPW, homogenizuj 60–120 s. Przygotuj rozcieńczenia dziesiętne.

⏱ Czas: 10 min

2. Przygotowanie podłoża MYP

Rozpuść 46 g MYP Agar Base w 900 mL wody destylowanej. Sterylizuj w autoklawie (121°C/15 min). Schłodź do 45–50°C, dodaj aseptycznie 100 mL emulsji żółtka i roztwór polimyksyny B. Rozlej 15–20 mL na płytki, pozostaw do zestalenia i wysuszenia.

⏱ Czas: 45 min • 🌡 Temperatura: 45–50°C

3. Posiew powierzchniowy

Nałóż 0,1 mL każdego rozcieńczenia na powierzchnię płytki MYP. Rozprowadź szpatułką Drigalskiego. Pozostaw do wchłonięcia inokulum (ok. 15 min).

⏱ Czas: 10 min

4. Inkubacja

Odwróć płytki i inkubuj w 30 ± 1°C przez 18–24 h w warunkach tlenowych.

⏱ Czas: 18–24 h • 🌡 Temperatura: 30°C

5. Odczyt kolonii na MYP

Policz kolonie typowe dla B. cereus: duże (~5 mm), różowe (mannitol-ujemne), otoczone strefą białego precypitatu (lecytynaza+). Zlicz również kolonie atypowe (różowe bez precypitatu).

⏱ Czas: 15 min

6. Test hemolizy (potwierdzenie)

Wybierz min. 5 typowych i 5 atypowych kolonii. Posiej na agar z krwią baranią, rozdzielając kolonie tak, aby umożliwić ocenę hemolizy. Inkubuj 24 ± 2 h w 30°C.

⏱ Czas: 24 h • 🌡 Temperatura: 30°C

7. Ocena hemolizy

B. cereus wykazuje silną β-hemolizę (przejaśnienie wokół kolonii). Oblicz odsetek potwierdzonych izolatów.

⏱ Czas: 10 min

8. Obliczenia i raportowanie

Oblicz liczbę domniemanego B. cereus z uwzględnieniem odsetka potwierdzonych kolonii. Wynik wyraź w jtk/g. Wynik raportuj jako „Bacillus cereus domniemany".

⏱ Czas: 10 min

Wymagany sprzęt i aparatura

SprzętPrzykładOrientacyjna cena
Inkubator laboratoryjny 30°CBinder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 535 000–18 000 PLN
Komora laminarna klasy IIThermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream AC225 000–60 000 PLN
Stomacher / homogenizatorSeward Stomacher 400 Circulator, BagMixer 40012 000–25 000 PLN
Łaźnia wodna 44–47°CMemmert WNB 14, Julabo TW 123 000–10 000 PLN
Autoklaw laboratoryjnyTuttnauer 2540M, Systec VX-6515 000–45 000 PLN

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

OdczynnikCASSzczegóły
MYP Agar Base (podłoże Mossela)69-65-8Pepton, ekstrakt mięsny, mannitol, chlorek sodu, czerwień fenolowa, agar; op. 500 g
Emulsja żółtka jaja (Egg Yolk Emulsion 50%)—Suplement do MYP — wykrywa aktywność lecytynazy, 100 mL do 900 mL podłoża
Polimyksyna B (suplement selektywny)1405-20-5Antybiotyk hamujący bakterie Gram-ujemne; stężenie robocze 100 IU/mL; op. 10 fiolek
Agar z krwią baranią (Columbia Blood Agar)—Do testu hemolizy — potwierdzenie B. cereus (β-hemoliza); gotowe płytki
D-Mannitol69-65-8Cukier alkoholowy — system indykatorowy w MYP (B. cereus mannitol-ujemny)
Czerwień fenolowa (Phenol Red)143-74-8Wskaźnik pH w podłożu MYP — zmiana barwy przy fermentacji mannitolu
Woda peptonowa buforowana (BPW)—Do rozcieńczeń próbki, op. 500 g

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

🔍 Znajdź laboratorium wykonujące to badanie