🍎 Azotany i azotyny w produktach mięsnych — redukcja reduktazą azotanową, reakcja Griessa, spektrometria 540 nm
Krótko: o co chodzi
Wodny ekstrakt 10 g zhomogenizowanej próbki (pH 8,0–8,5, 15 min we wrzącej łaźni, klarowanie odczynnikami Carreza) reaguje z sulfanilamidem i dichlorowodorkiem N-(1-naftylo)etylenodiaminy; azotany oznacza się po redukcji do azotynów reduktazą azotanową z NADPH; pomiar przy 540 nm po 30 min. Badanie wykonuje się według normy PN-EN 12014-3:2006; Zakres walidacji: 9–22 mg/kg azotynów (NaNO2) i 23–48 mg/kg azotanów (NaNO3); stosowalność 5–125 mg/kg sumy jako NaNO2. Procedura obejmuje 9 kroków (łącznie około 46–46 min); stosuje się je m.in. do: Kontrola zawartości azotynów i azotanów (E249–E252) w wędlinach, konserwach i wyrobach garmażeryjnych, Nadzór urzędowy nad limitami substancji dodatkowych w przetworach mięsnych, Badania peklowania i przemian azotanów podczas dojrzewania wędlin.
W skrócie
- Norma: PN-EN 12014-3:2006
- Kategoria: Chemia żywności
- Kroków procedury: 9
- Łączny czas etapów: 46 min–46 min
- Zakres walidacji: 9–22 mg/kg azotynów (NaNO2) i 23–48 mg/kg azotanów (NaNO3); stosowalność 5–125 mg/kg sumy jako NaNO2
- Odważka i ekstrakcja: 10 g (do 10 mg), 50 ml wody + 50 ml gorącej wody, pH 8,0–8,5, 15 min we wrzącej łaźni, kolba 200 ml
- Klarowanie: Po 4 ml roztworów Carreza nr 1 i nr 2; sączek karbowany, pierwsze 20 ml przesączu odrzucić
Przegląd
Norma określa spektrometryczną metodę oznaczania zawartości azotanów i azotynów w produktach mięsnych, zwalidowaną dla różnych produktów o zawartości 9–22 mg/kg azotynów (jako azotyn sodu) i 23–48 mg/kg azotanów (jako azotan sodu); z doświadczeń wynika, że metoda nadaje się też do całkowitej zawartości azotynów i azotanów od 5 do 125 mg/kg w przeliczeniu na azotyn sodu. EN 12014-3:2005 zastąpiła ENV 12014-3:1998 i należy do serii „Oznaczanie zawartości azotanów i/lub azotynów” (część 2: HPLC/IC dla warzyw, część 4: IC dla produktów mięsnych, część 5: metoda enzymatyczna dla żywności dla niemowląt, część 7: metoda przepływowa po redukcji kadmem). Opis oparto na podglądzie EN 12014-3:2005 (do pkt 6.2.1); PN-EN 12014-3:2006 z poprawką Ap1:2008 jest w wykazie procedur badawczych zeszytu branżowego QAFP dla konserw.
Azotan(V) sodu i potasu (E251, E252) oraz azotan(III) sodu (E250) są stosowane jako dodatki w przetwórstwie mięsnym: azotany nadają przetworom różową barwę, aromat i peklowniczy smak, azotyny działają przeciwutleniająco i hamują rozwój Clostridium botulinum i C. perfringens; azotyn sodu jest jednak potencjalnie rakotwórczy (nitrozoaminy) i wywołuje methemoglobinemię. Według przepisów przywołanych w Bromatologii i Chemii Toksykologicznej (2009) azotyny stosuje się wyłącznie w mieszance z NaCl zawierającej 0,5–0,6 % NaNO2, w salami zawartość azotanów(III) ma być poniżej 60 mg/kg, a suma azotanów(III) i (V) nie może przekraczać 600 mg/kg; w pozostałych wędlinach, wyrobach garmażeryjnych i pasteryzowanych konserwach łączna zawartość nie może przekraczać 125 mg/kg.
Zasada oznaczania azotynów opiera się na reakcji Griessa: azotyny tworzą z sulfanilamidem sól diazoniową, która sprzęga się z N-(1-naftylo)etylenodiaminą w czerwony barwnik azowy; azotany w ekstrakcie redukuje się do azotynów reduktazą azotanową (zamiast kolumny kadmowej) i oblicza z różnicy dwóch pomiarów.
Zasada metody
Zhomogenizowaną próbkę (temperatura poniżej 25 °C; maszynka z otworami ≤ 4,5 mm, dwukrotne przepuszczenie) w ilości 10 g (do 10 mg) homogenizuje się z ok. 50 ml wody 30–60 s, spłukuje 50 ml gorącej wody, doprowadza pH do 8,0–8,5 roztworem NaOH ok. 1 mol/l i ogrzewa 15 min we wrzącej łaźni, wstrząsając. Po ostudzeniu ekstrakt przenosi się do kolby 200 ml, dodaje po 4 ml roztworów Carreza nr 1 (150 g heksacyjanożelazianu(II) potasu w 1 l) i nr 2 (230 g octanu cynku w 1 l), uzupełnia wodą i sączy przez sączek karbowany wolny od azotanów i azotynów, odrzucając pierwsze 20 ml. Azotyny: 2,0 ml roztworu miesza się z 1,0 ml wody i 3,0 ml mieszaniny odczynników barwnych (równe objętości roztworu 8 g sulfanilamidu w 1 l z 330 ml HCl i roztworu 0,330 g dichlorowodorku N-(1-naftylo)etylenodiaminy w 250 ml), przechowuje w ciemności i po 30 min mierzy absorbancję przy 540 nm wobec wody. Azotany: porcję ekstraktu inkubuje się z buforem imidazolowym pH 7,8, NADPH z FAD i reduktazą azotanową (Aspergillus sp., EC 1.6.6.2) — powstałe azotyny razem z pierwotnymi reagują z odczynnikami barwnymi; zawartość azotanów oblicza się z różnicy. Krzywe wzorcowe sporządza się z roztworów azotynu sodu (0,13–0,53 mg NO2− w 200 ml) i azotanu potasu (0,14–0,55 mg w przeliczeniu na azotyn), przygotowanych z klarowaniem Carreza jak próbki.
Zastosowania
- Kontrola zawartości azotynów i azotanów (E249–E252) w wędlinach, konserwach i wyrobach garmażeryjnych
- Nadzór urzędowy nad limitami substancji dodatkowych w przetworach mięsnych
- Badania peklowania i przemian azotanów podczas dojrzewania wędlin
- Procedura badawcza systemu jakości QAFP dla konserw mięsnych
- Metoda bez kadmu — alternatywa dla redukcji kadmowej w laboratoriach ograniczających odpady toksyczne
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Zakres walidacji | 9–22 mg/kg azotynów (NaNO2) i 23–48 mg/kg azotanów (NaNO3); stosowalność 5–125 mg/kg sumy jako NaNO2 |
| Odważka i ekstrakcja | 10 g (do 10 mg), 50 ml wody + 50 ml gorącej wody, pH 8,0–8,5, 15 min we wrzącej łaźni, kolba 200 ml |
| Klarowanie | Po 4 ml roztworów Carreza nr 1 i nr 2; sączek karbowany, pierwsze 20 ml przesączu odrzucić |
| Reakcja barwna | 2,0 ml roztworu + 1,0 ml wody + 3,0 ml mieszaniny odczynników, 30 min w ciemności, 540 nm wobec wody |
| Redukcja enzymatyczna | Bufor imidazolowy pH 7,8; 125 mg NADPH-Na4 i 2,5 mg FAD w 50 ml buforu; 11 mg reduktazy azotanowej (ok. 0,4 U/mg) w 10 ml buforu z 50 mg EDTA (trwała ok. 14 dni w 4 °C) |
| Wzorce | NaNO2 400 mg/l → 20 mg/l → 0,13; 0,27; 0,40; 0,53 mg NO2−/200 ml; KNO3 600 mg/l → 30 mg/l → 0,14–0,55 mg jako azotyn |
Norma
- Numer normy
- PN-EN 12014-3:2006
- Tytuł (PL)
- Artykuły żywnościowe — Oznaczanie zawartości azotanów i/lub azotynów — Część 3: Spektrometryczne oznaczanie zawartości azotanów i azotynów w produktach mięsnych po enzymatycznej redukcji azotanów do azotynów
- Title (EN)
- Foodstuffs — Determination of nitrate and/or nitrite content — Part 3: Spectrometric determination of nitrate and nitrite content of meat products after enzymatic reduction of nitrate to nitrite
Procedura krok po kroku
-
Homogenizacja
Zhomogenizować próbkę laboratoryjną tak, aby temperatura nie przekroczyła 25 °C; przy maszynce przepuścić co najmniej dwa razy.
-
Ekstrakcja
Odważyć 10 g (do 10 mg) do szerokoszyjnej kolby stożkowej, dodać ok. 50 ml wody, homogenizować 30–60 s, spłukać wał homogenizatora 50 ml gorącej wody. Ustawić pH 8,0–8,5 roztworem NaOH (pH-metr); dla surowych wyrobów nie przekraczać 8,5, dla parzonych i gotowanych można do ok. 9,5.
-
Ogrzewanie
Ogrzewać kolbę 15 min we wrzącej łaźni wodnej, kilkakrotnie wstrząsając; ostudzić do temperatury pokojowej.
-
Klarowanie
Przenieść ilościowo do kolby miarowej 200 ml, dodać po 4 ml roztworu Carreza nr 1 i nr 2, wstrząsając po każdym dodaniu; uzupełnić wodą, wymieszać, przesączyć przez sączek karbowany, odrzucając pierwsze 20 ml przesączu (roztwór próbki).
-
Roztwory wzorcowe
Do serii kolb 200 ml odmierzyć 10, 20, 30 i 40 ml rozcieńczonego roztworu azotynu sodu (0,13; 0,27; 0,40; 0,53 mg NO2−) oraz — osobno — azotanu potasu (0,14; 0,27; 0,41; 0,55 mg jako azotyn), ustawić pH 8,0–8,5, dodać po 4 ml Carreza nr 1 i nr 2, uzupełnić, przesączyć, odrzucając pierwsze 20 ml.
-
Oznaczanie azotynów
Zmieszać w probówce 2,0 ml roztworu (próbki lub wzorca) z 1,0 ml wody i 3,0 ml mieszaniny odczynników barwnych, wstrząsnąć i przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej; po 30 min zmierzyć absorbancję przy 540 nm wobec wody.
-
Oznaczanie azotanów
Porcję roztworu próbki (i wzorców azotanowych) inkubować z buforem imidazolowym, roztworem NADPH/FAD i roztworem reduktazy azotanowej zgodnie z pkt 6 normy, a następnie wykonać reakcję barwną jak dla azotynów.
-
Krzywe wzorcowe i obliczenia
Wykreślić absorbancje wzorców względem masy azotynów (mg w 200 ml). Odczytać zawartość azotynów w próbce i zawartość całkowitą po redukcji; azotany obliczyć z różnicy, wyrażając wyniki w mg NaNO2 i NaNO3 na kg.
-
Sprawozdanie
Podać identyfikację próbki, odwołanie do EN 12014-3, wyniki dla azotynów i azotanów, datę i odstępstwa od normy; dane precyzji z załącznika A.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Homogenizator | Szybkoobrotowy nóż rotacyjny lub maszynka do mięsa z sitem o otworach ≤ 4,5 mm | — |
| Łaźnia wodna | Utrzymująca 100 °C | — |
| pH-metr | Z elektrodą szklaną i odniesienia, do ustawiania pH 8,0–8,5 | — |
| Spektrometr | Pomiar przy 540 nm; kuwety szklane lub z tworzywa bez absorpcji przy 540 nm | — |
| Sączki karbowane | Wolne od azotanów i azotynów | — |
| Kolby miarowe 200 ml i 500 ml, pipety, probówki | Do roztworów wzorcowych i reakcji barwnej | — |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Sulfanilamid | 63-74-1 | Odczynnik barwny nr 1: 8 g w 500 ml wody na łaźni, po ostudzeniu 330 ml kwasu solnego 37 % (bez azotynów), uzupełnić do 1 l; trwały kilka tygodni |
| Dichlorowodorek N-(1-naftylo)etylenodiaminy | 1465-25-4 | Odczynnik barwny nr 2: 0,330 g w 250 ml wody, w ciemnej butelce, wymieniany co tydzień; mieszanina odczynników 1 + 1 (v/v) w dniu użycia |
| Roztwory Carreza | 14459-95-1 | Nr 1: 150 g K4[Fe(CN)6]·3H2O w 1 l (ciemna butelka, wymiana co dwa miesiące); nr 2: 230 g octanu cynku dwuwodnego (CAS 5970-45-6) w 1 l |
| Azotyn sodu | 7632-00-0 | Roztwór podstawowy 400 mg/l (200 mg do 0,1 mg w 500 ml; 2 tygodnie w 4 °C), rozcieńczony 20 mg/l |
| Azotan potasu | 7757-79-1 | Roztwór podstawowy 600 mg/l (300 mg w 500 ml), rozcieńczony 30 mg/l |
| Imidazol, NADPH-Na4, FAD, reduktaza azotanowa | 288-32-4 | Bufor: 0,68 g imidazolu w 80 ml wody, pH 7,8 kwasem solnym 2 mol/l, do 100 ml; roztwór NADPH z FAD przygotowywany bezpośrednio przed użyciem; enzym (Aspergillus sp., EC 1.6.6.2) — dostępny jako zestaw testowy „Nitrat”; wodorotlenek sodu ok. 1 mol/l |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Kwas solny 37 % w odczynniku barwnym — wyciąg, okulary, rękawice
- Dichlorowodorek N-(1-naftylo)etylenodiaminy i azotyn sodu — unikać pylenia i kontaktu ze skórą; azotyn sodu toksyczny po połknięciu
- Wrząca łaźnia wodna i homogenizacja gorącym ekstraktem — ochrona przed poparzeniem
- Odczynniki Carreza zawierają heksacyjanożelazian — nie zakwaszać odpadów (ryzyko uwolnienia cyjanowodoru)
Najczęstsze pytania
Jaka norma opisuje to badanie?
Badanie wykonuje się według normy PN-EN 12014-3:2006 — „Artykuły żywnościowe — Oznaczanie zawartości azotanów i/lub azotynów — Część 3: Spektrometryczne oznaczanie zawartości azotanów i azotynów w produktach mięsnych po enzymatycznej redukcji azotanów do azotynów”. Tytuł angielski: „Foodstuffs — Determination of nitrate and/or nitrite content — Part 3: Spectrometric determination of nitrate and nitrite content of meat products after enzymatic reduction of nitrate to nitrite”.
Na czym polega ta metoda?
Zhomogenizowaną próbkę (temperatura poniżej 25 °C; maszynka z otworami ≤ 4,5 mm, dwukrotne przepuszczenie) w ilości 10 g (do 10 mg) homogenizuje się z ok. 50 ml wody 30–60 s, spłukuje 50 ml gorącej wody, doprowadza pH do 8,0–8,5 roztworem NaOH ok.
Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?
Zakres walidacji: 9–22 mg/kg azotynów (NaNO2) i 23–48 mg/kg azotanów (NaNO3); stosowalność 5–125 mg/kg sumy jako NaNO2; Odważka i ekstrakcja: 10 g (do 10 mg), 50 ml wody + 50 ml gorącej wody, pH 8,0–8,5, 15 min we wrzącej łaźni, kolba 200 ml; Klarowanie: Po 4 ml roztworów Carreza nr 1 i nr 2; sączek karbowany, pierwsze 20 ml przesączu odrzucić; Reakcja barwna: 2,0 ml roztworu + 1,0 ml wody + 3,0 ml mieszaniny odczynników, 30 min w ciemności, 540 nm wobec wody.
Ile trwa wykonanie badania?
Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 46 min–46 min. Procedura obejmuje 9 kroków.
Jaki sprzęt jest potrzebny?
Homogenizator, Łaźnia wodna, pH-metr, Spektrometr, Sączki karbowane, Kolby miarowe 200 ml i 500 ml, pipety, probówki.
Gdzie stosuje się to badanie?
Kontrola zawartości azotynów i azotanów (E249–E252) w wędlinach, konserwach i wyrobach garmażeryjnych; Nadzór urzędowy nad limitami substancji dodatkowych w przetworach mięsnych; Badania peklowania i przemian azotanów podczas dojrzewania wędlin; Procedura badawcza systemu jakości QAFP dla konserw mięsnych; Metoda bez kadmu — alternatywa dla redukcji kadmowej w laboratoriach ograniczających odpady toksyczne.
Jakie środki ostrożności obowiązują?
Kwas solny 37 % w odczynniku barwnym — wyciąg, okulary, rękawice; Dichlorowodorek N-(1-naftylo)etylenodiaminy i azotyn sodu — unikać pylenia i kontaktu ze skórą; azotyn sodu toksyczny po połknięciu; Wrząca łaźnia wodna i homogenizacja gorącym ekstraktem — ochrona przed poparzeniem; Odczynniki Carreza zawierają heksacyjanożelazian — nie zakwaszać odpadów (ryzyko uwolnienia cyjanowodoru).
Które laboratorium wykona to badanie?
Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN 12014-3.