🍎 Azot ogólny i białko w produktach rolno-żywnościowych — metoda Kjeldahla (mineralizacja, destylacja, miareczkowanie)

Chemia żywności PN-A-04018

Przegląd

Metoda Kjeldahla, znana od 1883 r. i niewiele od tej pory modyfikowana, jest najczęściej stosowaną i referencyjną metodą oznaczania azotu w artykułach spożywczych. Polega na mineralizacji produktu ze stężonym kwasem siarkowym(VI) („na mokro”), zalkalizowaniu roztworu, oddestylowaniu i ilościowym oznaczeniu powstałego amoniaku. Oznacza się w ten sposób azot ogólny, w którego skład obok azotu białkowego wchodzi azot z produktów rozkładu białek i innych związków organicznych (jony amonowe, grupy amidowe, aminowe, iminowe); nie oznacza się azotu azotanów(III) i (V) ani azotu aromatycznych pierścieni heterocyklicznych. Norma PN-A-04018:1975 ze zmianą Az3:2002 jest przywoływana w publikacjach naukowych o składzie mięsa (białko = N × 6,25, zestaw Büchi) oraz w wykazie metodyk WSSE; jej tekst nie był dostępny — opis oparto na instrukcjach Politechniki Gdańskiej i Uniwersytetu Gdańskiego i przed wdrożeniem należy go sprawdzić z normą.

Przeciętna zawartość azotu w białkach wynosi około 16 %, dlatego dla tzw. białka surowego stosuje się mnożnik 6,25 (100 : 16); ponieważ białka poszczególnych produktów różnią się zawartością azotu, stosuje się mnożniki szczegółowe: białko jaja kurzego 6,67, mleka 6,38, mięsa 6,25, żyta, pszenicy i owsa 5,70 — mnożnik podaje się obok wyniku (np. dla mleka N × 6,38). Metody pośrednie można stosować tylko wtedy, gdy produkt nie zawiera innych związków azotowych lub zawiera ich bardzo mało. Do oznaczenia pobiera się taką próbkę, aby zawierała około 0,02 g azotu (z reguły około 0,5–1,5 g produktu).

Zasada metody została wykorzystana w automatycznych zestawach (aparat do mineralizacji, jednostka do destylacji lub destylacji i automatycznego miareczkowania), pozwalających na wykonanie ponad stu analiz dziennie.

Zasada metody

Mineralizacja: w kolbie lub probówce Kjeldahla związki organiczne utleniają się w stężonym kwasie siarkowym w obecności katalizatora (siarczan(VI) miedzi(II), rtęci(II), selen lub mieszanina selenowo-miedziowa), często z dodatkiem siarczanu(VI) potasu lub sodu podwyższającego temperaturę wrzenia kwasu i ewentualnie utleniacza (nadtlenek wodoru); azot przechodzi w siarczan amonu (w instrukcji PG: kwaśny siarczan amonu, mineralizacja w 380–410 °C, próbka zmineralizowana ma barwę ciemnobrunatną). Destylacja: po dodaniu roztworu mocnej zasady (30–33 % NaOH) uwolniony amoniak oddestylowuje się z parą wodną do odbieralnika z nadmiarem kwasu borowego (25 cm³ nasyconego roztworu ze wskaźnikiem mieszanym: czerwień metylowa + zieleń bromokrezolowa), gdzie wiąże się w sól amonową kwasu borowego; alternatywnie do odmierzonej ilości kwasu siarkowego 0,1 N, którego nadmiar odmiareczkowuje się NaOH. Miareczkowanie: związany amoniak miareczkuje się mianowanym roztworem kwasu solnego (np. 0,01 M) lub siarkowego do powrotu barwy wskaźnika sprzed absorpcji amoniaku. Obliczenie: %N = 14·V·c·100/m (V — objętość kwasu, c — stężenie, m — masa suchej odważki), białko = %N × mnożnik.

Zastosowania

• Oznaczanie białka ogólnego w mięsie i przetworach mięsnych, mleku, zbożach, paszach i innych produktach rolno-żywnościowych
• Deklaracja wartości odżywczej (białko = N × mnożnik) i kontrola zgodności ze specyfikacją
• Metoda odniesienia do kalibracji analizatorów pośrednich (NIR, spektrometria w podczerwieni)
• Podstawowy skład chemiczny surowców w badaniach naukowych (białko N × 6,25)
• Ćwiczenia z analizy żywności i chemii analitycznej (analiza elementarna azotu)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-A-04018:1975 (+Az3:2002)

Tytuł (PL)

Produkty rolniczo-żywnościowe — Oznaczanie azotu metodą Kjeldahla i przeliczanie na białko

Title (EN)

Agricultural food products — Determination of nitrogen by the Kjeldahl method and conversion to protein (tłumaczenie robocze)

Procedura krok po kroku

1. Odważka

   Odważyć do probówki rozkładowej próbkę zawierającą ok. 0,02 g azotu (zwykle 0,5–1,5 g); dla produktów suchych oznaczyć równolegle wilgotność, aby przeliczyć na suchą masę.

2. Mineralizacja

   Dodać katalizator (Se lub CuSO4 z K2SO4) i 5 cm³ stężonego kwasu siarkowego; probówki umieścić w mineralizatorze, zamknąć puste otwory, założyć nasadkę odsysającą połączoną z pompką wodną i grzać (termoregulator na pełnej mocy). Po ok. 10 min sprawdzić, czy próbka się zmineralizowała; po zakończeniu wyjąć probówki z nasadką i studzić ok. 10 min, następnie opłukać ścianki ok. 10 cm³ wody.

   ⏱ Czas: ok. 10 min + studzenie • 🌡 Temperatura: 380–410 °C

3. Sprawdzenie aparatu destylacyjnego

   Napełnić zbiorniki wody i ługu, otworzyć wodę chłodzącą, wstawić pustą probówkę i odbieralnik, przedestylować ok. 100 cm³ wody (przepłukanie), wyłączyć parę.

4. Destylacja

   Wstawić probówkę z próbką i odbieralnik z 25 cm³ nasyconego kwasu borowego ze wskaźnikiem; dozować ok. 20 cm³ ługu 30 % NaOH, włączyć parę i destylować do zebrania ok. 100 cm³ destylatu; koniec chłodnicy spłukać wodą.

   ⏱ Czas: do ok. 100 cm³ destylatu

5. Miareczkowanie

   Miareczkować zawartość odbieralnika kwasem solnym 0,01 M do powrotu barwy wskaźnika sprzed pochłonięcia amoniaku (pomocny roztwór porównawczy). W wariancie z kwasem siarkowym w odbieralniku — odmiareczkować niezwiązany kwas 0,1 N NaOH do zielonego zabarwienia wskaźnika Tashiro.

6. Próba kontrolna

   Wykonać próbę ślepą ze wszystkimi odczynnikami bez próbki i uwzględnić ją w obliczeniach.

7. Obliczenia

   %N = 14·V·c·100/m (V — objętość kwasu w cm³, c — stężenie w mol/dm³, m — masa suchej odważki w g); w wariancie odwrotnym %N = (M1 − M2)·n·0,014·100/m. Białko = %N × mnożnik (6,25 ogólny; 6,38 mleko; 5,70 zboża; 6,67 jajo). Podać niepewność z powtórzeń (RSD, k = 2).

8. Sprawozdanie

   Podać zawartość azotu i białka z użytym mnożnikiem, masę odważki, katalizator i wariant metody (ręczny/automatyczny).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Stężony kwas siarkowy w 380–410 °C — mineralizacja wyłącznie pod wyciągiem z odsysaniem oparów (SO2, mgła kwasu), okulary, fartuch, rękawice kwasoodporne
• Selen i związki miedzi/rtęci jako katalizatory są toksyczne — odważać w rękawicach, odpady jako chemiczne
• Stężony NaOH 30–33 % i gorąca destylacja z parą — ryzyko poparzeń i wyrzutu; dozować ług automatycznie, nie otwierać aparatu pod ciśnieniem pary
• Kwas solny i kwas borowy — standardowe środki ochrony

Najczęstsze pytania