🍎 Oznaczanie aflatoksyny M1 w mleku (także o obniżonej zawartości tłuszczu i odtłuszczonym) i mleku w proszku — próbkę przepuszcza się przez kolumnę z przeciwciałami przeciw aflatoksynie M1, matrycę wymywa wodą, toksynę eluuje i oznacza metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją fluorescencyjną względem wzorców 0,05–0,80 ng/ml; granica wykrywalności 0,005 µg/kg w mleku i 0,05 µg/kg w mleku w proszku, granica oznaczalności 0,01 i 0,1 µg/kg, PN-EN ISO 14501

Chemia żywności PN-EN ISO 14501

Przegląd

CO TA NORMA OPISUJE. Tekst normy czytamy w próbce iTeh dokumentu ISO 14501:2021 | IDF 171:2021 (tekst angielski): strona tytułowa, spis treści, przedmowy ISO i IDF, ostrzeżenia, rozdziały 1–5 i rozdział 6 do punktu 6.10 (aparat HPLC) — próbka kończy się na stronie 4. Dalszej części aparatury, postępowania (przygotowanie mleka i mleka w proszku, kolumna, oczyszczanie, warunki HPLC, krzywa, schemat nastrzyków), obliczeń, precyzji, sprawozdania i załącznika A z wynikami badania międzylaboratoryjnego nie czytamy; tytuły znamy ze spisu treści.

WEDŁUG TEKSTU ISO 14501:2021. Trzecie wydanie przygotował ISO/TC 34 „Produkty spożywcze”, podkomitet SC 5 „Mleko i przetwory mleczne” z Międzynarodową Federacją Mleczarską (IDF), we współpracy z CEN/TC 302 „Mleko i przetwory mleczne — Metody pobierania próbek i analizy” (porozumienie wiedeńskie); zastępuje drugie wydanie ISO 14501 | IDF 171:2007. Główna zmiana według przedmowy: brak szczegółowych objaśnień w niektórych punktach prowadził do różnego wykonywania metody w laboratoriach — doprecyzowano je na podstawie praktyki rutynowych użytkowników. Spis treści: 8 Postępowanie (8.2 przygotowanie próbek: mleko, mleko w proszku; 8.3 przygotowanie kolumny powinowactwa immunologicznego; 8.4 oczyszczanie; 8.5 HPLC: ustawienie pompy, sprawność chromatograficzna, krzywa kalibracyjna, analiza oczyszczonych ekstraktów i schemat nastrzyków), 9 Obliczanie i wyrażanie wyników (9.1 mleko odtłuszczone, 9.2 mleko odtłuszczone w proszku), 10 Precyzja, 11 Sprawozdanie, załącznik A (informacyjny) „Wyniki badania międzylaboratoryjnego”. Ostrzeżenia: aflatoksyny są rakotwórcze dla ludzi (stanowisko IARC/WHO); laboratorium chroni się przed światłem dziennym, a roztwory wzorcowe przed światłem (np. folią aluminiową); szkło niemyte kwasem może powodować straty aflatoksyny M1 z roztworów wodnych — nowe szkło moczy się kilka godzin w rozcieńczonym kwasie (np. H2SO4 2 mol/l) i płucze do pH 6–8; odpady i szkło odkaża się według procedur IARC. Zakres (1): oznaczanie aflatoksyny M1 w mleku i mleku w proszku; najniższy poziom walidacji 0,08 µg/kg dla pełnego mleka w proszku, czyli 0,008 µg/l dla mleka odtworzonego; granica wykrywalności 0,05 µg/kg dla mleka w proszku i 0,005 µg/kg dla mleka płynnego; granica oznaczalności 0,1 µg/kg dla mleka w proszku i 0,01 µg/kg dla mleka płynnego; metoda dotyczy także mleka o obniżonej zawartości tłuszczu i odtłuszczonego oraz takiego mleka w proszku. Powołań normatywnych norma nie ma (2). Definicja (3.1): zawartość aflatoksyny M1 — stężenie (µg/l) albo ułamek masowy (µg/kg) oznaczony procedurą tej normy. Zasada (4): próbkę przepuszcza się przez kolumnę z przeciwciałami związanymi na nośniku; przeciwciała wiążą aflatoksynę M1 w kompleks antygen–przeciwciało, pozostałe składniki wymywa się wodą, toksynę eluuje, a jej ilość w eluacie oznacza HPLC z detekcją fluorymetryczną. Odczynniki (5): kolumna powinowactwa immunologicznego o pojemności nie mniejszej niż 100 ng aflatoksyny M1 (2 µg/l przy 50 ml próbki) i odzysku nie mniejszym niż 80 % przy 4 ng (80 ng/l przy 50 ml) — sprawdzana regularnie, co najmniej raz dla każdej partii kolumn: pojemność (2,0 ml roztworu podstawowego 0,1 µg/ml do 50 ml wody, przez kolumnę, elucja, HPLC) i odzysk (0,8 ml roztworu roboczego 0,005 µg/ml do 50 ml; stężenie nie mniejsze niż 0,064 µg/l; można też materiałem odniesienia); acetonitryl HPLC, roztwory 25 % i 10 % (V/V), odgazowane; azot; roztwór kalibracyjny ok. 10 µg/ml w acetonitrylu ze stężeniem ustalanym z absorbancji w maksimum ok. 350 nm (zakres 330–370 nm): ρ1 = A · M · 100 / (d · ε), M = 328 g/mol, ε = 1 985 m²/mol, d = 1 cm — albo certyfikowany materiał odniesienia (np. BCR-423, 10 µg/ml w chloroformie); roztwór podstawowy 0,1 µg/ml w acetonitrylu 25 %, szczelnie zamknięty, w folii, w 1–5 °C w ciemności — trwały co najmniej dwa miesiące, potem przed użyciem sprawdza się stężenie; roztwory robocze 0,005 µg/ml w wodzie z acetonitrylem 9 : 1, przygotowywane w dniu użycia, a z nich np. 0,05; 0,10; 0,20; 0,40 i 0,80 ng/ml (inne rozcieńczenia zależnie od pętli dozującej; lepszy kształt piku bywa przy rozcieńczaniu mieszaniną o składzie eluentu). Aparatura (6, do 6.10): strzykawki 10 i 50 ml; układ próżniowy (kolba Büchnera, system Vac-Elut albo pompa perystaltyczna); wirówka ≥ 2000 g; pipety 1, 2 i 50 ml; zlewki 250 ml; kolba miarowa 100 ml; łaźnie wodne 30 ± 2 °C, 35–37 °C i 50 ± 5 °C; sączki Whatman nr 42; stożkowe probówki szklane 5, 10 i 20 ml; HPLC z pompą bez pulsacji, przepływ ok. 1 ml/min, nastrzyk 20–500 µl.

STATUS (stan na 03.10.2026). W wyszukiwarce PKN (hasło „14501”, 03.10.2026) PN-EN ISO 14501:2021-10 w wersji polskiej i angielskiej („Wprowadza: EN ISO 14501:2021 [IDT], ISO 14501:2021 [IDT]”) nie mają adnotacji o wycofaniu; PN-EN ISO 14501:2009 (wersja polska) — „Wycofana i zastąpiona przez PN-EN ISO 14501:2021-10 – wersja angielska”, a wcześniejsze wydania (2007, 2002) — wycofane i zastąpione kolejnymi; pozostałe wyniki (PN-EN 14501 o zasłonach i żaluzjach, PN-B-14501 o zaprawach) dotyczą innych dziedzin. Karta wersji polskiej: data publikacji 12.01.2023, 16 stron, KT 35 Mleka i Przetworów Mlecznych, ICS 67.100.10, „Zastępuje PN-EN ISO 14501:2009 – wersja polska”, bez adnotacji o wycofaniu. W katalogu iTeh (odczyt 03.10.2026) ISO 14501:2021 ma status „Published”, etap 90.93 (norma międzynarodowa potwierdzona).

ILE LABORATORIÓW I W JAKIEJ POSTACI (kopia bazy zakresów akredytacji, wsad do 17.09.2026, odczyt 03.10.2026). Numer 14501 stoi w 5 rekordach u 4 laboratoriów: AB 400, AB 451, AB 465 (2), AB 515. W aktualnych dokumentach PCA (odczyt 03.10.2026; AB 451 wyd. nr 26 z 24.11.2025, AB 465 wyd. nr 31 z 23.12.2025, AB 400 wyd. nr 37 z 07.08.2026, AB 515 wyd. nr 30 z 12.08.2026) numer stoi w 5 wierszach u tych samych 4 laboratoriów; w każdym dokumencie liczba znaczników stron równa się liczbie stron PDF, bez powtórzeń; przeszukanie wszystkich dokumentów PCA pobranych z BIP 03.10.2026 nie dało laboratoriów spoza kopii bazy. Postać „PN-EN ISO 14501:2021-10” (AB 451, AB 515), „PN-EN ISO 14501” bez roku (AB 400) oraz „PN-EN ISO 14501” po „Procedury badawcze” (AB 465 — żywność; przy paszach dodatkowo z PN-EN 15792). Żadna z tych pozycji nie jest zawieszona. Zakładka „Laboratoria” (hasło „PN-EN ISO 14501”) pokazuje wszystkie 4 laboratoria — sprawdzone zapytaniem zakładki na serwerze produkcyjnym labcoda.pl 03.10.2026.

CO BADAJĄ LABORATORIA (pozycje w PCA). Przedmiot: mleko, mleko zagęszczone, mleko w proszku, w tym przeznaczone dla niemowląt i małych dzieci (AB 515); produkty żywnościowe na bazie mleka, w tym dla małych dzieci i niemowląt, mleko (AB 451); żywność (AB 400); żywność i pasze (AB 465). Cecha: zawartość aflatoksyny M1 (AB 400, AB 451, AB 515), zawartość mykotoksyn (AB 465). Zakresy: (0,004–0,32) µg/l lub µg/kg (AB 515), (0,017–0,24) µg/kg (AB 451); AB 400 i AB 465 zakresu nie podają. Technika: HPLC z detekcją fluorescencyjną; przy paszach AB 465 — HPLC z detekcją spektrofotometryczną i/lub fluorescencyjną.

GDZIE ŁATWO O WYNIK POZORNIE POPRAWNY. Przy dolnej granicy: według normy granica wykrywalności w mleku płynnym wynosi 0,005 µg/kg, a oznaczalności 0,01 µg/kg (1) — zakres AB 515 zaczyna się od 0,004 µg/l lub µg/kg, poniżej obu tych wartości; najniższy poziom walidacji normy to 0,008 µg/l dla mleka odtworzonego. Przy matrycy: zakres normy to mleko i mleko w proszku (1); AB 451 stosuje ją do produktów na bazie mleka, a AB 465 do żywności i pasz z ogólną cechą „zawartość mykotoksyn” — przy paszach z PN-EN 15792:2012, normą o zearalenonie w paszach (karta PKN: publikacja 26.03.2012, KT 40 Pasz, bez adnotacji o wycofaniu, odczyt 03.10.2026), więc dwie normy dzielą tam różne toksyny, a nie są alternatywą. Przy szkle: szkło niemyte kwasem pochłania aflatoksynę M1 z roztworów wodnych (ostrzeżenie 3). Przy kolumnie: każda partia kolumn ma wykazać pojemność ≥ 100 ng i odzysk ≥ 80 % (5.1) — dlatego norma każe sprawdzać każdą partię kolumn osobno, przed analizą próbek. Przy wzorcach: stężenie roztworu kalibracyjnego ustala się spektrofotometrycznie, a roztwór podstawowy starszy niż dwa miesiące sprawdza przed użyciem (5.4.1, 5.4.2). Przy jednostce: wynik w µg/l (mleko płynne) i w µg/kg (mleko w proszku) to różne wielkości (3.1) — AB 515 podaje zakres „µg/l lub µg/kg” jedną parą liczb.

CZEGO NIE PODAJEMY. Przygotowania próbek mleka i mleka w proszku, warunków HPLC, wzorów obliczeniowych, danych precyzji i wyników badania międzylaboratoryjnego nie przytaczamy — leżą poza próbką. Nie podajemy najwyższych dopuszczalnych poziomów aflatoksyny M1 z przepisów.

Zasada metody

Próbkę mleka (albo odtworzonego mleka w proszku) przepuszcza się przez kolumnę z przeciwciałami przeciw aflatoksynie M1; toksyna wiąże się w kompleks antygen–przeciwciało, pozostałe składniki wymywa się wodą. Aflatoksynę M1 eluuje się i oznacza metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją fluorescencyjną względem roztworów wzorcowych (np. 0,05–0,80 ng/ml), których stężenie ustala się spektrofotometrycznie przy ok. 350 nm.

Zastosowania

• Aflatoksyna M1 w mleku (pełnym, o obniżonej zawartości tłuszczu, odtłuszczonym) i mleku w proszku; LOQ 0,01 µg/kg i 0,1 µg/kg (1)
• Mleko, mleko zagęszczone i w proszku, także dla niemowląt i małych dzieci, produkty na bazie mleka, żywność i pasze — pozycje w zakresach akredytacji 4 laboratoriów w PCA

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 14501:2021-10

Tytuł (PL)

Mleko i mleko w proszku — Oznaczanie zawartości aflatoksyny M1 — Oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa immunologicznego i oznaczanie za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej

Title (EN)

Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M1 content — Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by high-performance liquid chromatography

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie laboratorium i szkła

   Ochrona przed światłem dziennym, szkło myte kwasem (ostrzeżenia 2, 3). PN-EN ISO 14501:2021-10 bez adnotacji o wycofaniu w PKN (03.10.2026).

2. Kontrola kolumn

   Pojemność (2,0 ml roztworu 0,1 µg/ml w 50 ml) i odzysk (0,8 ml roztworu 0,005 µg/ml w 50 ml, ≥ 0,064 µg/l) dla każdej partii (5.1).

3. Wzorce

   Stężenie roztworu kalibracyjnego z absorbancji przy ok. 350 nm; robocze 0,05–0,80 ng/ml w dniu użycia (5.4).

4. Oczyszczanie

   Próbka przez kolumnę, płukanie wodą, elucja aflatoksyny M1 (4; szczegóły w rozdziale 8, poza próbką).

5. HPLC i wynik

   Detekcja fluorescencyjna, krzywa kalibracyjna; wynik w µg/l albo µg/kg (3.1, 4; obliczenia w rozdziale 9, poza próbką).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Aflatoksyny są rakotwórcze dla ludzi — praca z roztworami wzorcowymi w wyznaczonym miejscu, odkażanie odpadów i szkła według procedur IARC (ostrzeżenia 1, 4)
• Acetonitryl — łatwopalny i toksyczny; praca pod wyciągiem

Najczęstsze pytania