FDA aktualizuje metodę BAM dla Cronobacter (wydanie z września 2026 r.): wtórne namnażanie w bulionie CSB dla mleka początkowego w proszku, procedura dla próbek środowiskowych i nowa sonda qPCR
Amerykańska Agencja Żywności i Leków (FDA) opublikowała wydanie z września 2026 r. rozdziału 29 podręcznika Bacteriological Analytical Manual (BAM) — metody wykrywania i izolacji Cronobacter spp. w mleku początkowym w proszku (PIF) i w próbkach środowiskowych. Strona metody jest aktualna na 16 września 2026 r.; poprzednie wydanie rozdziału pochodziło z listopada 2023 r.
- Namnażanie: liczbę porcji hodowli namnażającej poddawanych wirowaniu zmniejszono z trzech do jednej. Jako podejście równoważne dla PIF dodano wtórne namnażanie z odpowiadającą mu ekstrakcją DNA — 0,1 ml hodowli w buforowanej wodzie peptonowej (BPW) przenosi się do 10 ml bulionu CSB i inkubuje w 41,5 ± 1 °C przez 24 ± 2 h. Według FDA namnażanie wtórne w CSB ułatwia izolację Cronobacter z próbek z dużą florą towarzyszącą, a qPCR po dwuetapowym namnażaniu BPW–CSB daje wynik dzień później niż qPCR wykonane bezpośrednio po namnażaniu w BPW i wirowaniu.
- Dodano procedurę namnażania, przesiewowego qPCR i potwierdzenia hodowlanego dla próbek środowiskowych (wymaz w 9 ml BPW, gąbka w 90 ml BPW). W qPCR, którego celem jest fragment operonu syntezy makrocząsteczek obejmujący koniec 3′ genu rpsU i koniec 5′ genu dnaG, wprowadzono preferowaną podwójnie wygaszaną sondę dla Cronobacter, równoważny sposób przygotowania wewnętrznej kontroli amplifikacji i wyższą temperaturę przyłączania starterów.
- Zaktualizowano wymagane i opcjonalne podłoża chromogenne — w schemacie analizy wydania z 2026 r. są to agar DFI (36 ± 1 °C), agar CCI i agar R&F (41,5 ± 1 °C), a opcjonalnie agar ESIA (44 ± 1 °C) i agar R&F w 36 ± 1 °C, każdy przez 24 ± 2 h — oraz tabele inkluzywności i ekskluzywności: metodę sprawdzono na 50 szczepach Cronobacter reprezentujących siedem gatunków i na 40 szczepach 34 gatunków innych niż Cronobacter.
- Metoda łączy przesiewowe real-time PCR z częścią hodowlaną, którą można stosować samodzielnie, bez qPCR; dodatni wynik qPCR zawsze potwierdza się metodą hodowlaną. Czyste kultury potwierdza się qPCR i systemem VITEK 2 albo samym qPCR. Wydanie z listopada 2023 r. wycofało m.in. użycie aparatu SmartCycler do qPCR i możliwość potwierdzenia hodowlanego testem RAPID ID 32E, a dodało opcjonalne podłoża CCI i ESIA.